Методы обнаружения бактерий и определения их численности

Существует большое количество классиче­ских и инструментальных методов оценки со­держания и активности микроорганизмов, однако почти все из них предназначены для анализа клеток в жидких средах, и только не­многие методы позволяют характеризовать численность и состояние микроорганизмов на поверхности материалов. В этих условиях од­ним из традиционно используемых подходов для оценки микробной загрязненности объек­тов является взятие смывов микроорганизмов с поверхностей с последующим их анализом прямыми и косвенными методами.

Прямые способы анализа дают абсолютное значение содержания микроорганизмов. Они, как правило, не характеризуют активность клеток. Среди прямых методов анализа в лабораторной практике широко применяются способы посева и культивирования микроорганизмов на поверх­ности агаризованных питательных сред. Данные методы просты, высокочувствительны, не тре­буют измерительного оборудования, поэтому используются на производстве и в арбитражных случаях. Основные недостатки способов культи­вирования связаны с высокой длительностью трудоемкостью, большим расходом питательных, сред и экономической неэффективностью при большом количестве микробиологических испы­таний. Поэтому наблюдается тенденция их заме­ны на инструментальные методы.

Косвенные методы микробиологического анализа характеризуют содержание и активность микроорганизмов. Они быстры, точны, имеют низкие трудозатраты и экономически эффектив­ны при увеличении количества измерений. Эти способы нуждаются в инструментальных сред­ствах измерений и дают относительное значение показателей, что требует проведения процедуры калибровки средств измерений с помощью пря­мых методов микробиологического анализа [11].

Рассмотрим методы обнаружения бактерий и определения их численности на примере бактерий, вызывающих порчу пищевых продуктов.

1.3.1.1 Методы культивирования

В традиционных методах исследования пищевых продуктов на присутствие спе­цифической микробиоты порчи используется методология культирования на со­ответствующих средах. Образец пищевого продукта размачивают или гомогенизи­руют, используя гомогенизатор или блендер, и приготавливают соответствующие разбавления, которые высевают на селективные или полуселективпые среды для последующего выделения и идентификации колоний. Численность ассоциируемых с порчей молочнокислых бактерий (МКБ) обычно оценивают путем подсчета колоний.

Ряд ограничений этой методологии не всегда позволяет обнаружить микроор­ганизмы, ответственные за изменение органолептических свойств продукта, что может привести к ошибочной идентификации или недооценке бактерий порчи. Результаты зависят от нескольких факторов: правильного выбора культуральной среды, физиологического состояния бактерий и применяемого способа их иден-тификации.

Для определения численности молочнокислых бактерий (МКБ), присутствующих в испорченном пищевом продукте, предложены самые разные культуральные среды, в том числе MRS и агар Rogosa. Для улучшения роста МКБ и предотвращения роста дрожжей среду MRS можно модифицировать путем добавления 0,1% цистеингидрохлорида и 0,02% сорбата калия. Кроме того, можно изменить значение рН до 5,7; предпочтитель­нее использовать анаэробное культивирование. Последняя среда успешно исполь­зуется для анализа микробиоты МКБ порчи в копченых сосисках в ва­куумной упаковке. Другие модификации MRS-агара используются для идентификации карнобактерий, участвующих в порче мясного сырья, мяса птицы и морепродуктов в вакуумной упаковке.

Для селективного обнаружения карнобактерий пригодны к использованию агар CTAS (крезоловый красный – таллий – ацетат – сахароза) и агар EBRER. Кро­ме того, в качестве селективной среды для подсчета карнобактерий может быть использован агар CTSI(крезоловый красный – таллий – сахароза – инулин), представляющий собой модификацию CTAS-агара. Альтернативой MRS-агару является агар NAP (нитрит – ацетоин – полимиксин), первоначально созданный для обнару­жения МКБ мяса. Он позволяет выявлять лактобациллы, энтерококки и карнобактерии, причем последние были идентифицированы как доминирующие МКБ порчи и в том и в другом продукте.

После культивирования предполагаемых бактерий порчи на соотвествующих культуральных средах необходимо их идентифицировать. В большинстве случаев ко­лонии отбираются из чашек Петри и после пересева (субкультивирования) штам­мов применяют несколько процедур идентификации. В качестве альтернативы для определения принадлежности колоний к тому или иному виду микроорганизмов можно использовать методы гибридизации колоний. Существенную роль для ре­зультата анализа играет отбор изолятов из серии разбавлений испорченного пище­вого продукта,. Если необходима характеризация доминирующей популяции МКБ, то в целях идентификации вида должны отбираться только колонии из наивысших разбавлений.

1.3.1.2 Фенотипические методы

Классическая идентификация МКБ основывается на морфологических, физиоло­гических и биохимических характеристиках. В большинстве идентификационных ключей используются такие характеристики, как морфология клетки, рост при определенных температурах, газообразование при утилизации глюкозы и тип проду­цируемого изомера молочной кислоты, а также спектр ассимилируемых или сбра­живаемых углеводов и источников азота. В настоящее время доступны малогаба­ритные тест-наборы для фенотипического фингерпринтинга, в которых для получения фенотипического «отпечатка» используются набор дегидрированных реагентов и добавка унифици­рованного инокулята. Данные, получаемые с помощью этих автоматизированных систем, должны тщательно интерпретироваться, так как этим системам и присущи ряд ограничений. Качество результатов существенно зависит от надежности базы данных. Как правило, эти фенотипические методы характеризуются довольно низ­кой воспроизводимостью и низким таксономическим разрешением, что зачастую не позволяет различать близкородственные микроорганизмы.

Более надежный метод идентификация МКБ – это полный анализ клеточных белков. Сравнение состава клеточных белков, получаемого с помощью унифици­рованного метода SDS-PAGE (натрийдодецилсульфат-полиакриломидный гель- электрофорез), помогает идентифицировать МКБ, вызывающих порчу вин, сыров и МКБ, вызывающих порчу морепродуктов.

Для ускоренной идентификация МКБ порчи может использоваться инфракрас­ная спектроскопия на основе преобразования Фурье (FFIR).

1.3.1.3 ДНК-методы

Для обнаружения и идентификации бактерий порчи применяются различные ДНК-методы, разработанные, в основном, за последние 20 лет. Одним из их преимуществ является независимость от изменения условий роста микроорганизмов. Эти методы идентификации включают секвенирование последовательностей 165 или 235 рДНК, ПЦР-анализы с применением родо- или видоспецифических прай- меров, а также методы ДНК-фингерпринтинга, основанные на структурах ПЦР-амплифицированиых фрагментов ДНК или на рестрикционных анализах всей ДНК или ампликонов, полученных с помощью селективной ПЦР (полиморфизм длины фрагментов рестрикции, RFLP).

1.3.1.3.1 ПЦР-методы

В настоящее время не существует специфических олигонуклеотидных праймеров для обнаружения с помощью ПЦР-методов отдельных видов Pseudomonas (напри­мер, P. fluorescens, P. lundensis и P.fragi). Тем не менее для различения видов Pseudomonas, выделяемых из различных окружающих сред, ПЦР-методы и RFLP-анализ (RFLP – полиморфизм длины фрагментов рестрикции) могут использоваться совместно. Для обнаружения и определения количества псевдомонад в мясе и молоке также может использоваться ПЦР в сочета­нии с методом ELISA (иммуносорбентный анализ с ферментной меткой).

1.3.1.3.2 Риботипирование

Одним из ускоренных методов идентификации бактерий является риботипирование с гибридизацией зондов специфических генов рРНК и геномных ДНК-дайджестов с последующим компьютерным анализом сохраненных профилей генов рРНК для каждого вида Pseudomonas. Риботипирование может выполняться вручную или с помощью автоматизированной системы. Этот метод успешно используется для описания признаков псевдомонад, выделенных из сырого молока.

1.3.1.3.3 Секвенирование рРНК

Популярным средством идентификации P. fragi, S. putrefaciens и Р. fluorescens становится прямое секвенирование сегмента последовательности 16S РНК. Применение автоматизированного тест-набора для секвенирования по­следовательности 16S рРНК ускорило и облегчило идентификацию видов Pseudomonas и Sh­ewanella.

1.3.1.3.4 Импедиметрия

Рост и активность бактерий порчи можно также оценить, анализируя изменения импеданса в культуральной среде или в пищевых продуктах под влия­нием метаболизма бактерий. К сожалению, попытки отслеживания измене­ний численности псевдомонад в сыром молоке методами импедиметрии оказались успешными лишь частично.

Использование специфических праймеров для ПЦР-реакции с бактериальной ДНК, экстрагированной из образца – это самый быстрый независящий от культу- ральной среды метод родо-, видо- или штаммоспецифического обнаружения в пищевой матрице. Он позволяет обнаружить определенные микроорганиз­мы порчи, присутствующие в пищевом продукте во время технологического про­цесса, без применения продолжительных процедур культивирования.

1.3.1.4 Методы, применяемые без предварительного культивирования

Еще один не зависящий от культуральной среды подход включает применение методов гибридизации in situ, в которых искусственно созданные олигонуклео- тиды присоединяются к специфическим последовательностям – мишеням (обыч­но 165 рДНК) бактериальной ДНК. Наиболее часто применяется флуоресцент­ная гибридизация in situ (FISH), особенно для обнаружения бактерий в напитках, в том числе в вине. Этот метод позволяет за несколько часов произвести прямую идентификацию и количественный микроскопический анализ МКБ без предвари­тельного культивирования. Бактериальные клетки образца, проницаемые для флуоресцентно меченного олигонуклеотида, фиксируют и иммобилизуют на пред­метных стеклах или мембранных фильтрах, гибридизируют in situ с зондом, а затем подсчитывают под эпифлуоресцентным микроскопом. Гибридизацияю in situ можно также сочетать с проточной цитометрией.

Эпифлуоресцентная микроскопия (DEFT), включающая захват бактериальных клеток на поверхности мембранных фильтров и окрашивание флуорохромом, на­шла применение в молочной и винной промышленности.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и температурно- временной градиентный гель-электрофорез (TGGE) могут применяться как не за­висящие от культуральной среды методы обнаружения и анализа МКБ, вызываю­щих порчу пищевых продуктов. В этих методах изменяющийся участок гена 165 рРНК амплифицируется посредством ПЦР, и фрагменты ДНК одинакового разме­ра разделяются на полиакриламидном геле в соответствии с их денатурирующим профилем. Полученные полосы можно оцифровывать и нормализовать, используя эталонные структуры, с последующей идентификацией расположения полос путем их сравнения со структурами из базы данных эталонных штаммов. Данный подход использовался для идентификации лактобацилл, участвующих в брожении дрожжевого теста, и для изучения микробиоты сыров. Метод PCR – DGGE, включающий идентификацию полос с помощью секвенирования, применяется для анализа порчи мясных продуктов под действием МКБ на мясоперерабаты­вающем заводе.

1.3.1.5 Тесты на ассимиляцию углеводов, жирнокислотные профили и моноклональные антитела

Классическими, стандартными процедурами идентификации псевдомонад являют­ся физиологическая характеризация и тесты на ассимиляцию углеводов. Необходимые тесты могут выполняться вручную или с помощью автоматизированных тест-наборов.

Вид псевдомонад, вызывающих порчу пищевых продуктов, можно определить также с помощью анализа жирнокислотного состава бактериальных клеток.

В качестве белка-мишени для обнаружения псевдомонад могут использоваться белки внешней мембраны Pseudomonas. Для различения флуоресцентных и нефлуо­ресцентных псевдомонад используют липопротеин I и ген, кодирующий этот бе­лок. Белок OprF внешней мембраны и антитело к этому белку используют для обнаружения псевдомонад из группы I подобия рРНК. Поликлональные анти­тела по отношению к белку внешней мембраны (F) и живым клеткам P. fluorescens используют для обнаружения псевдомонад в охлажденном мясе. В настоящее время разработаны также моноклональные антитела для специфического белка внешней мембраны Pseudomonas, которые используются для обнаружения псевдомонад в охлажден­ном мясе непрямым методом ELISA.

1.3.1.6 Методы обнаружения, идентификации и количественного определения спорообразующих бактерий

1.3.1.6.1 Аэробные и факультативные анаэробные спорообразующие бактерии

Представителей рода Bacillus и близкородственных им родов выделяют по их харак­теристикам роста или типу порчи. В методах количественного опреде­ления микроорганизмов, вызывающих порчу сильнокислых, кислых, подкислен­ных и слабокислых пищевых продуктов, используют значения рН и температурный диапазон роста, а также тип порчи (например, плоскокислая) под действием кон­кретных групп микроорганизмов. Общим тестом для представителей рода Bacillus является тест на «аэробные мезофильные спорообразующие бактерии», причем В. cereus –единственный вид, для которого имеется специфическая селективная среда. Подсчет аэробных спор может производиться разными методами, но обычно используют триптоновый агар с декстрозой или глюкозой. Для психротрофных микроорганизмов разработан модифицированный метод Миколайчика с при­менением теплового шока при 75 °С в течение 20 мин, хранения образцов при 7,2 ° С в течение 8–10 суток и последующим посевом на стандартный агар. Метод, который обычно используют для выделения мезофильных аэробных спорообразующих бактерий, включает посев на чашки с глюкозо-триптоновым ага­ром после нагревания до 80 °С в течение 30 мин с последующим аэробным куль­тивированием при 35 °С.

После этого для идентификации изолятов можно использовать различные мето­ды, включая молекулярные и более традиционные, основанные на биохимических или фенотипических свойствах. К сожалению, традиционные методы характери­зуются довольно ограниченной способностью различения видов и зачастую не согласуются с результатами идентификации, полученными с использованием таких относительно новых методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) и ДНК-ДНК-гибридизация. Кроме того, отсутствуют селективные культуральные среды, позволяющие обнаруживать виды микроорганизмов, относящиеся к данной группе. Тем не менее классические методы все еще остаются полезными, особенно в тех случаях, когда оказываются недостаточными или неудовлетворительными такие методы, как секвенирование последовательности 165рРНК/ДНК. Альтерна­тивным подходом, применяемым для различения видов Bacillus, для их идентифи­кации и таксономии, является профилирование белков методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight, матрич­ная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия). Для В. pumilus этот метод хорошо коррелирует с секвенированнем gyrBи ДНК-ДНК гибридизацией. Идентификация аэробных спорообразую­щих бактерий всегда была трудной задачей, и хотя в настоящее время появился ряд тонких методов, не всегда пригодных для повседневного применения, фенотипическая характеризация по-прежнему остается важным инструментом идентифи­кации.

Способы идентификации Alicyclobacillus spp. отличаются по различающей спо­собности и сложности; в некоторых из них используются ПЦР-методы, гомология ДНК-ДНК и сравнительный анализ рибосомных последовательно­стей или анализ случайно амплифицированной полиморфной ДНК а в других – более практичные методы, например метод прямого эпифлуоресцентного фильтра, образование в чашках постороннего запаха или стандартные биохимические и морфологические тесты.

Для идентификации В. coagulans, а также других видов этого рода и близко­родственных родов обычно применяют биохимические тест-наборы совместно с микроскопией, гидролизом казеина и характеристиками роста (температура и анаэробный рост). Для их диффенциации используют и другие методы, в том числе анализ состава жирных кислот, состава оснований ДНК, секвенирование гена после­довательности 165 рРН, подходы, основанные на RAPD или их ком­бинации. Для ряда аэробных спорообразующих бактерий порчи, включая P. macerans, разработаны ПЦР-методы обнаружения, использующие праймеры, мишенями которых являются видоспецифические последовательности гена 165рРНК.

1.3.1.6.2 Анаэробные спорообразующие бактерии

Подсчет анаэробных бактерий может производиться с использованием десятичных разбавлений и RCM-агара или методом наиболее вероятного количе­ства (MPN) с использованием пробирок со средой DRCM.

Идентификацию клостридий обычно проводят путем оценки фенотипических свойств изолятов, включая разжижение желатина, продуцирование индола, провер­ки подвижности, положения спор, востановления нитрата и сбраживания углево­дов. Для анализа конечных продуктов брожения может применяться газожидкост­ная хроматография. В качестве альтернативы могут также использоваться профили биохимических реакций, име­ющимися в тест-наборах. Для идентификации и харакгеризации анаэробных микроорганизмов, Bacillus и других близкородственных аэробных спорообразующих бактерий разработаны новые методы, в том числе с использова­нием антител, например ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, твердофазный иммуноферментный анализ) и ДНК-методы. Разработанные ДНК-зонды и ПЦР-методы, основанные на специфических последовательностях 165 рРНК, успешно применяются для идентификации различных клостридиальных видов, в частности С. tyrobutyricum.