Рассмотрим методы определения метаболической активности микроорганизмов на примере участвующих в биобрастании аэробных и анаэробных бактерий под действием биоцидов.
На сегодняшний день существует только один стандартизированный количественный метод оценки устойчивости материалов к воздействию бактерий. Его суть заключается в инкубировании аэробных бактерий на поверхности образца биозащищенного материала в течение определенного времени с последующим смывом и определением числа сохранивших жизнеспособность клеток.
Однако, реализация этого метода с опытными образцами показала, что данные материалы обладают очень развитой пористой поверхностью и хорошими адсорбционными свойствами, в результате, сохранившие жизнеспособность клетки остаются адсорбировавшимися на поверхности образца и не образуют колонии при высеве. Таким образом, возникает существенная погрешность в определении концентрации выживших клеток, что делает данный метод непригодным для достижения указанных целей.
|
|
В то же время, известны подходы к определению степени биозащищенности материалов, основанные на сопоставлении метаболической активности прикрепленных к поверхности образца бактерий. Эти методы обладают преимуществами при анализе антимикробных свойств пористых материалов с развитой поверхностью.
Для оценки метаболической активности анаэробных бактерий разработан количественный анаэробно–суспензионный метод оценки устойчивости материаловканаэробной биокоррозии. В качестве тест-культур в нем используются облигатно анаэробные сульфатредуцирующие бактерии, осуществляющие специфический способ запасания энергии – сульфатное дыхание, при котором происходит диссимиляционное восстановление соединений серы с образованием сероводорода и сульфидов. Суть этого метода заключается в определении содержания сероводорода в культуральной жидкости после совместного инкубирования сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) с образцом в среде, не содержащей ионов железа, в специальном анаэробном биореакторе. Регистрацию количества сероводорода проводят фо- токолориметрически на основе цветной реакцииобразования метиленового синего. Схематически данный анализ представлен на рисунке 2.
Рисунок 2 – Схема анаэробно-суспензионного метода определения антибактериальных свойств биозащищенных материалов
Проверку полученных в результате анализа результатов можно осуществлять при помощи стандартного качественного метода, основанного на инкубировании СРБ в питательной среде, содержащей железо, с последующей визуальной регистрирацией образования черных зон сульфида, которые и учитываются при оценке бактерио- стойкости по трехбалльной шкале.
|
|
Для оценки антибактериальных свойств образцов биозащищенного материала по отношению к аэробным бактериям Pseudomonas fluoresceins был разработан метод оценки дыхательной активности клеток.
Для этого необходимо провести совместное инкубирование культуры бактерий, находящейся в log-фазе роста, с опытными образцами в течение суток. Для интенсификации дыхательного процесса необходимо создать благоприятные условия, поместив данную суспензию с образцом в свежий питательный бульон с последующим динамическим измерением в нем остаточного содержания растворенного молекулярного кислорода. Схема данного анализа приведена на рисунке 3.
Рисунок 3 – Схема метода определения дыхательной активности бактерии
В основу принципа измерения положен амперометрический метод анализа. На рисунке 4, представленном ниже, отображены графики зависимости содержания кислорода в культуральных жидкостях от длительности процесса дыхания.
Рисунок 4 –Динамика изменения содержания кислорода в культуральной жидкости
Чтобы повысить разрешающую способность метода, в качестве основного показателя антимикробных свойств образцов используется скорость потребления кислорода К, мг/л·мин:
К = ∆С / ∆t, (1)
где ∆С – изменение концентрации кислорода за время ∆t, мг/л;
∆t – время измерения, мин.
Описанные методы позволяют получить схожие результаты и демонстрируют зависимость между концентрацией биоцида в составе материала и его устойчивостью к биообрастанию: чем больше концентрация биоцида, тем большей бактериостойкостью характеризуется материал.
Описанные количественные методы, основанные на измерении метаболической активности аэробных и анаэробных бактерий являются более объективными по сравнению со стандартными методами для оценки устойчивости к биообрастанию образцов биозащищенных материалов. Результаты анаэробно-суспензионного метода и метода определения дыхательной активности аэробных бактерий рода P. fluorescens коррелируют между собой, что дает основание судить о сходной чувствительности к биоцидным добавкам наиболее распространенных аэробных и анаэробных бактерий, участвующих в биобрастании [13].