Экология микроорганизмов

Введение. Экология микроорганизмов является разделом об­щей микробиологии и изучает взаимоотношения микро- и макроорганизмов, совместно обитающих в определенных био­топах. В естественных средах обитания (почве, воде, воздухе, живых организмах) микробы входят в состав различных био­ценозов. Экология микробов, вызывающих заболевания чело­века, определяется их способностью выживать во внешней среде, менять хозяев, сохраняться в организме хозяина на фоне действия иммунной системы, а также связана со способами их распространения, передачи и рядом других факторов. Оценка ряда экологических условий является одной из главных задач санитарной микробиологии.

Санитарно-бактериологические исследования лежат в осно­ве практической работы санитарных врачей и эпидемиологов при санитарно-гигиенической оценке объектов окружающей среды, пищевых продуктов, напитков и т.д. и играют ведущую роль в профилактике инфекционных болезней. Важным объ­ектом изучения медицинской микробиологии является нор­мальная микрофлора организма человека, которая включает микробы, обитающие на кожных покровах, слизистых оболоч­ках различных органов (полости рта, зева, носоглотки, верхних участков дыхательных путей, кишечника, особенно толстой кишки, и т.д.). Одни из них являются постоянными (облигат-ными) обитателями организма человека, другие — временными (факультативными или транзиторными). Нормальная микро­флора — это жизненно важная система организма, которая обеспечивает защиту от многих патогенных микробов, созре­вание и стимуляцию иммунной системы, продукцию ряда ви­таминов и ферментов, участвующих в пищеварении, и др.

Качественный и количественный состав микрофлоры человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, харак­тера питания и др. Кроме того, колебания в составе микро­флоры человека могут быть обусловлены возникновением заболеваний и применением лекарственных препаратов, преж­де всего антибиотиков и иммуномодуляторов. Оценка ка­чественного и количественного состава микрофлоры орга­низма человека по определенным показателям позволяет вы­явить его нарушение (дисбактериоз) и связанные с ним по­следствия.

Тема 8.1. МИКРОФЛОРА ВОДЫ, ВОЗДУХА И ПОЧВЫ. МЕТОДЫ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ, ВОЗДУХА И ПОЧВЫ

▲ План

ж Программа

1. Микрофлора воды, воздуха и почвы.

2. Санитарно-показательные микроорганизмы и их зна­чение.

3. Методы определения коли-индекса, коли-титра и микробного числа воды.

4. Методы определения микробного числа воздуха.

5. Методы определения перфрингенс-титра, коли-титра и микробного числа почвы.

А Демонстрация

1. Санитарно-бактериологическое исследование воды методом мембранных фильтров.

2. Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Аппарат Кротова. Рост микроорганизмов на МПА в чашке Петри. Рост гемолитических стрептококков на кровяном агаре.

3. Санитарно-бактериологическое исследование почвы. Рост Proteus vulgaris (по Шукевичу).

а Задание студентам

1. Провести оценку санитарно-бактериологического со­стояния воды по результатам определения микробного числа, коли-индекса и коли-титра.

2. Провести оценку санитарно-бактериологического со­стояния воздуха по результатам определения микроб­ного числа.

3. Провести оценку санитарно-бактериологического со­стояния почвы по результатам определения микроб­ного числа, коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий.

4. Сделать посев смыва с кожи рук на глюкозопептон-ную среду.

▲ Методические указания

• Микробиологические методы исследования окружающей среды

Для оценки санитарно-гигиенического состояния различ­ных объектов окружающей среды, воды, пищевых продуктов и др. проводят санитарно-бактериологические исследования, це­левое назначение которых состоит в определении эпидемичес­кой опасности. Однако прямое обнаружение патогенных мик­робов связано с рядом трудностей, обусловленных прежде все­го низкой концентрацией данных микробов, которые, как пра­вило, не могут размножаться в воздухе, воде, почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике применяют косвен­ные методы, основанные на определении общей микробной обсемененности того или другого объекта и на обнаружении в нем так называемых санитарно-показателъных бактерий (табл. 8.1.1).

Таблица 8.1.1. Санитарно-показательные бактерии окружающей среды и пищевых продуктов

Объект	Характер загрязнения	Санитарно-показательные бактерии
Вода	Фекальное	Бактерии группы кишечных па­лочек Escherichia coli, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterococ-cus faecalis
Почва	То же	Те же бактерии и клостридии {Clostridium perfringens, CI. sporo-genes и др.)
	Промышленно-быто-	Термофильные бактерии, Proteus
	вые (разлагающиеся отбросы)	vulgaris
Пищевые	Фекальное	Бактерии группы кишечных па-
продукты		лочек S. faecalis, P. vulgaris
	Орально-капельное	Staphylococcus aureus
Предметы	Фекальное	Бактерии группы кишечных па-
обихода		лочек, P. vulgaris, E. faecalis
	Орально-капельное	S. aureus
Воздух	То же	S. aureus, S. pyogenes
Вода,	Промышленное	Производственные штаммы мик-
почва,		робов
воздух

О микробной обсемененности судят по микробному числу -общему количеству микробов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м³ воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оце­нивают по двум показателям — титру и индексу. За титр при­нимают тот минимальный объем или массу исследуемого ма­териала, в которых обнаруживают санитарно-показательные бактерии; индекс показывает количество санитарно-показа­тельных бактерий, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 м³ воздуха. К санитарно-показательным бактериям относятся представители облигатной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых средой оби­тания являются кишечник или респираторный тракт. Они об­ладают следующими свойствами: 1) постоянно выделяются в большом количестве из организма во внешнюю среду; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окру­жающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или респираторном тракте; 4) не способны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойст­ва. Перечисленные признаки присущи ряду бактерий, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды (см. табл. 8.1.1).

Санитарно-показательными микробами, свидетельствующи­ми о фекальном загрязнении окружающей среды, являются бак­терии группы кишечной палочки (БГКП). Они принадлежат к разным родам семейства Enterobacteriaceae. Дифференциально-диагностические признаки БГКП представлены в табл. 8.1.2. Обнаружение E.coli в каких-либо объектах окружающей среды или пищевых продуктах считается наиболее достоверным по­казателем свежего фекального загрязнения. Наличие бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно дав­нее фекальное загрязнение. Присутствие Clostridium perfrin-gens, С. sporogens и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде (в частности, в почве). Обнаружение в объектах окружающей среды Enterococ-cusfaecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. К группе термофильных бактерий относятся неродственные бактерии, представители различных семейств, способных раз­множаться при температуре 60 °С и выше {Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus и др.). Они не являются постоянными обитателями кишечника человека и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличе­ние количества этих бактерий может свидетельствовать о за­грязнении почвы разлагающимися отбросами, поскольку они размножаются в саморазогревающемся навозе и компостах.

Таблица 8.1.2. Дифференциально-диагностические признаки БГКП

Вид бактерий	Признак
	продук­ты сбра­живания	метило­вый красный	реак­ция Фо- геса— Проска- уэра	индоло- образо- вание	рост на цитрат- ной среде	рост в присут­ствии KCN

Escherichia Смесь + — +

coli кислот

Citrobacter То же + — р + +

freundii

Enterobacter Бутан- — + — + +

aerogenes диол

Условные обозначения: (+) — положительная реакция, (—) — от­рицательная реакция, р — различные реакции.

Бактерии, принадлежащие к роду Proteus {P.vulgaris и др.) семейства Enterobacterceae, широко распространены в природе. Эти гнилостные бактерии в большом количестве встречаются на разлагающихся останках животных и растений. Обнаруже­ние этих бактерий в каких-либо пищевых продуктах свидетель­ствует о гнилостном распаде.

Гемолитические стрептококки (S.pyogenes), являясь транзит­ными обитателями носоглотки и зева, выделяются с капелька­ми слизи воздушно-капельным путем. Сроки выживания гемо­литических стрептококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воздушно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микробами, содержащимися в зеве, носоглотке, верхних дыхательных путях человека и явля­ющимися возбудителями воздушно-капельных инфекций. Sta­phylococcus aureus является факультативным обитателем носо­глотки, зева, а также кожных покровов человека. Его присут­ствие в воздухе помещений или на находящихся там предметах является показателем воздушно-капельного загрязнения. Одно­временное обнаружение золотистого стафилококка и гемоли­тических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

• Санитарно-бактериологическое исследование воды

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов — в объемах 1,0; 0,1 и 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10—12 мл расплавленного и остуженного до 45—50 °С питательного агара, который тща-

тельно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1—2 сут. Воду из открытых водоемов засевают па­раллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 °С в течение 1 сут, а другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глу­бине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-титр воды — минимальное количество воды (мл), в котором обна­руживаются БГКП. Коли-индекс — количество БГКП в 1 л во­ды. Эти показатели определяют титрационным (бродильным) методом или методом мембранных фильтров.

Метод титрования. Производят посев различных объ­емов воды в глюкозопептонную среду (1 % пептонная вода, 0,5 % раствор глюкозы, 0,5 % раствор хлорида натрия, инди­катор Андреде и поплавок), причем для посевов больших ко­личеств (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Воду открытых поверхностных водоемов исследуют в объ­емах 100; 10; 1,0 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 °С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб произво­дят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по методу Грама и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семей­ства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бак­терий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2—3 изолированные колонии с поверхности среды, наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную ди-метил-п-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицатель-ные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питательный агар с 0,5 % раствором глюкозы и инкубируют при 37 °С в течение 1 сут. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической табл. 8.1.3.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Мем­бранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрованием разводят стерильной

Таблица 8.1.3. Определение индекса бактерий группы кишечных палочек при исследовании воды

Коли индекс

Количество положительных результатов

Пределы индекса

Коли-титр

нижний

верхний

из 3 объ­емов по 10 мл

из 3 объ­емов по 1 мл

из 3 объ­емов по 100 мл

			Менее 3	—	—	Более 3300
				0,5
				0,5
				0,5
						0,9
			Более! 100	—	—	Менее 0,9

водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение 1 сут подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2—3 колоний красного цвета готовят мазки, окра­шивают по методу Грама и определяют оксидазную активность. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтро­вальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2—3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5 % раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 °С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс. Нормативные показатели для питьевой воды приведены в табл. 8.1.4.

Таблица 8.1.4. Нормативы для питьевой воды (ГОСТ 2874-82)

Норматив

Показатель

Число микробов в 1 мл воды, не более 100

Число бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды 3

(коли-индекс), не более

Для определения титра Enterococcus faecalis готовят 10-крат­ные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме 1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, поли-

миксиновая и др.), инкубируют при 37 "С в течение 2 сут, через 24 и 48 ч производят высевы на плотные элективно-дифферен­циальные среды: агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетра-золий-хлоридом), полимиксинтеллуритный агар. Идентифици­руют стрептококки по виду колоний, морфологии клеток и окраске по методу Грама. На среде с ТТХ стрептококки обра­зуют колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом — черного цвета.

Состав сред. Среда КФ:2% питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 2 % лактозы, 0,4 % азида натрия, 0,06 % карбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный.

Полимиксиновая среда: 2 % питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, полимиксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий.

Полимиксинтеллуритный агар: 2 % питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, кристалличес­кий фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0,01 % теллурита калия.

Агар трифенилтетразолий-хлорид (ТТХ): 2 % пита­тельного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, кристаллический фиолетовый 1:800 000, 0,01 % ТТХ.

При определении индекса E.faecalis пользуются статистичес­кими таблицами, применяемыми при установлении коли-ин-декса. Кроме того, с этой целью используют метод мембранных фильтров. Для обнаружения патогенных бактерий воду пропус­кают через мембранные фильтры, которые затем помещают в жидкие элективные среды или на поверхность плотных диф­ференциально-диагностических сред.

• Санитарно-бактериологическое исследование воздуха

Определение микробного числа воздуха. Количественные ми­кробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильт­рации.

Седиментационный метод. Две чашки Петри с пита­тельным агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37 "С. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чис­тым; 250—500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колоний более 500 — загрязненным.

Аспирационный метод. Это более точный количест­венный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляют с помощью приборов. Аппарат Кротова (рис. 8.1.1) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром.

Рис.8.1.1. Аппарат Кротова для бактериологического исследования

воздуха.

При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микро­организмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

а х 1000 ^х~ у

где а — количество выросших на чашке колоний; V — объем пропущенного через прибор воздуха, дм³; 1000 - стандартный объем воздуха, дм³.

При определении микробного числа воздуха используют питательный агар для выделения гемолитических стрептокок­ков — кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового с последующим контрольным микроскопированием и выбо­рочным пересевом подозрительных колоний на кровяной агар.

Состав сред. Кровяной агар с генциановым фиолето­вым: 2 % питательного агара, 5-10 % дефибринированной крови лошади, кролика или барана, генциановый фиолето­вый (1:50 000).

Желточно-солевой агар (ЖСА): 2 % питательного ага-ра, 10 % хлорида натрия, 20 % (по объему) желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Для исследования воздуха могут применяться и другие при­боры (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАБ-1 — пробоотбор-

ник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха), с помощью которых определенный объем воз­духа пропускают через жидкости или фильтры, а затем делают мерные посевы на питательные среды. Использование ПАБ-1 и ПОВ-1 позволяет исследовать большие объемы воздуха и обнаруживать патогенные бактерии и вирусы.

При исследовании воздуха стационаров (хирургических, аку-шерско-гинекологических и др.) осуществляют непосредствен­ное выделение патогенных и условно-патогенных бактерий — возбудителей внутрибольничных инфекций (стафилококков, синегнойной палочки и др.). При возникновении внутриболь­ничных инфекций стафилококковой этиологии проводят ис­следования, направленные на выявление источников и путей распространения инфекций: путем фаготипирования определя­ют идентичность стафилококков, выделенных из объектов ок­ружающей среды, а также от больных и обслуживающего пер­сонала. Нормативные показатели микробного числа и содер­жания Staphylococcus aureus, разработанные для воздуха боль­ничных помещений, приведены в табл. 8.1.5.

S.aureus (в 250 л)

Микробное число

Таблица 8.1.5. Критерии оценки микробного обсеменения воздуха в больничных помещениях

Место отбора проб

воды. Для определения перфрингенс-титра различные разведе­ния почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона—Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24—48 ч, после чего учитыва­ют результаты по свертыванию молока или по образованию черных колоний Clostridium perfringens в агаровом столбике сре­ды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр.

Состав сред. Среда Кесслера: 1 % пептона, 5 % желчи, 0,25 % лактозы, генциановый фиолетовый для подавления ро­ста грамположительных бактерий.

Железосульфитная среда Вильсона —Блера: 3 % пи­тательного агара, 1 % глюкозы, 2 % сульфита натрия, 0,08 % хлорида железа.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 °С, а затем подсчитывают количество выросших колоний и пересчитывают на 1 г почвы. Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является установление степени фекального загрязнения (табл. 8.1.6).

Операционные

до начала работы Не более 500 Не допускается

во время работы»» 1000 То же

Родильные комнаты»» 1000»»

Палаты для недоношенных детей»» 750»»

• Санитарно-бактериологическое исследование почвы

Определение микробного числа почвы. Почву берут на глуби­не 10—15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 10~³, Ю^-4, Ю^-5. Из двух последних разве­дений берут по 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7 % расплавлен­ного и остуженного до 45 ' С питательного агара, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2 % питательным агаром. Посевы инкубируют при 37 °С, затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют микробное число. Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Различные разведения почвенной су­спензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43 °С в течение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра

Таблица 8.1.6. Оценка санитарного состояния почвы по основным микробиологическим показателям

Характеристика почвы

Коли-титр

Перфрингенс-титр

Количество термофильных бактерий в 1 г почвы

Чистая 1,0 и выше 0,01 и выше 10²—10³

Загрязненная 0,9-0,01 0,009-0,0001 От 10³ до 10⁵

Сильно загрязнен- 0,009 и ниже 0,00009 и ниже От 10⁵ до 4x10⁶
ная

Тема 8.2. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДМЕТОВ ОБИХОДА И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

▲ План

▲ Программа

1. Определение фекального загрязнения предметов оби­хода и рук персонала.

2. Санитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов.

3. Санитарно-бактериологическое исследование мяса, мясных продуктов и консервов.

▲ Задание студентам

1. Определить присутствие E.coli на коже рук и предме­тах обихода методом смывов; сделать заключение.

2. Провести санитарно-бактериологическую оценку мо­лока, лимонада, мяса и мясных консервов.

3. Перечислить продукты, подлежащие контролю на ми-котоксины, антибиотики, консерванты, пестициды.

▲ Методические указания

Определение фекального загрязнения предметов обихода (ин­вентарь, оборудование, мебель, посуда, игрушки и др.) и рук персонала. Стерильным ватным тампоном, увлажненным изо­тоническим раствором хлорида натрия, делают смыв с иссле­дуемого предмета. Тампон помещают в среду Кесслера или втирают в поверхность среды Эндо. Посевы на плотных средах инкубируют при 37 "С, на жидких средах — при 43 "С.

Обсемененность предметов обихода золотистым стафило­кокком и фекальным стрептококком устанавливают аналогич­ным способом, используя для этого соответствующие питатель­ные среды (см. методы исследования воды и воздуха).

Санитарно-бактериологическое исследование молока и молоч­ных продуктов. О санитарно-бактериологическом состоянии молока и молочных продуктов судят по микробному числу и коли-титру. Для определения микробного числа пастеризован­ное молоко разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (1:10, 1:100, 1:1000) и по 1 мл каждого разве­дения выливают на дно стерильных чашек Петри, которые заливают расплавленным и остуженным агаром. Посевы инку­бируют при 37 "С в течение 1 сут, после чего подсчитывают количество выросших колоний. Для определения коли-титра цельное пастеризованное молоко засевают в б пробирок со средой Кесслера: в 3 пробирки вносят по 1 мл молока, а в остальные 3 — по 0,1 мл молока (1 мл молока разводят в 10 раз стерильной водой). Посевы инкубируют при 43 "С в тече­ние 1 сут, после чего из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и инкубируют при 37 "С. Из выросших колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по методу Грама, микроскопируют и делают посев на среду Козера, а также в пептонную воду с 1 % глюкозы. Пробирки с посевами на среде Козера инкубируют при 37 "С, а на среде с глюкозой — при 43 °С в течение 1 сут. При оценке результатов учитывают бактерии, вызывающие брожение глюкозы с образованием кислоты и газа, но не дающие роста на цитратной среде

Козера.

Аналогичным образом исследуют сливки, молочнокислые продукты, мороженое. Определяют величину коли-титра и про­водят оценку продукта в соответствии с нормативами (табл. 8.2.1; 8.2.2). Для обнаружения в молоке патогенных бактерий

делают посевы на соответствующие элективные и дифферен­циально-диагностические среды с последующим выделением чистых культур и их идентификацией.

Таблица 8.2.1. Определение коли-титра в молоке и других молочных продуктах (ГОСТ 9225-84)

Кишечная палочк;	i обнаружена в следующих объемах, мл	Кол и-титр, мл
1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
—	—	—	—	—	—	Более 3,0
+	—	—	—	—	—	3,0
+	+	—	—	—	—	Менее 3,0
+	+	+	—	—	—	Более 0,3
+	+	+	+	—	—	0,3
+	+	+	+	+	—	Менее 0,3
+	+	+	+	+	+	Более 0,03

Таблица 8.2.2. Санитарно-бактериологические нормативы для молока и молочных продуктов

Продукт	Микробное	Коли-	Регламентирую-
	число — допус-	титр	щий документ
	тимое количест-	не
	во микробов в 1 мл или 1 г, не более	менее
Молоко пастеризованное в
бутылках и пакетах:
группа А	5х104	3,0	ГОСТ 13277-79
группа Б	Ю5	0,3
Молоко во флягах и цис-	2x105	0,3	ГОСТ13277-79
тернах
Сливки пастеризованные:
группа А	Ю5	3,0	ОСТ 4964-74
группа Б	2х105	0,3
Кисломолочные продукты	Наличие толь-	0,3	ОСТ4929-84
(кефир, простокваша, аци-	ко микрофло-
дофилин)	ры закваски
Молоко сгущенное с саха-	105	0,1	СТ1390-78
ром
Кофе со сгущенным моло-	3,5х104	о,з	ГОСТ719-54
ком и сахаром
Какао со сгущенным моло-	3,5х104	0,3	ГОСТ 718-54
ком и сахаром
Мороженое	105	0,3	ОСТ 41156-80
Детские молочные смеси	5х102	11,1	Инструкция
пастеризованные и вареные			ГСК 123-13, 132-1469

Состав сред. Среда Козера: дистиллированная вода, 0,15 % фосфата натрия-аммония, 0,1 % фосфата калия одно-замещенного, 0,02 % сульфата магния, 0,25 % цитрата калия.

Санитарно-бактериологическое исследование напитков (лимо­над, минеральные воды). При исследовании лимонада и мине­ральных вод определяют микробное число и коли-титр, ис­пользуя при этом методы, применяемые для исследования пи­тьевой воды. Перед проведением исследования лимонад нейтрализуют 10 % раствором гидрокарбоната натрия, прове­ряя реакцию среды с помощью лакмусового индикатора. Ото­бранные пробы минеральной воды выдерживают при 43 "С в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр определяют методом мембранных фильтров. С этой целью 500 мл напитка фильтруют через мембранные фильтры (100 мл через 1 фильтр), после чего последние промывают стерильной водой для удале­ния остатков минеральных солей и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют при 37 "С. После определе­ния коли-индекса вычисляют коли-титр.

Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада и минеральных вод соответствуют нормативам питьевой водо­проводной воды. Такие же требования предъявляют к воде, используемой для приготовления кваса и различных фрукто-во-ягодных безалкогольных напитков.

Санитарно-бактериологическое исследование мяса, колбасных изделий и мясных продуктов. При микроскопическом исследо­вании мяса определяют количество бактерий в мазках-отпечат­ках, которые готовят из кусочков мяса размером 2x1,5x2,5 см. Мазки окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Мясо считается свежим, если в поле зрения обнаружено не более 10 бактериальных клеток.

Бактериологическое исследование колбасных изделий и мясных продуктов проводят в соответствии с ГОСТом 9958-81: определяют микробное число, а также устанавливают присут­ствие БГКП, сальмонелл, бактерий рода Proteus, коагулазопо-ложительных стафилококков и клостридий. Анализ проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб, которые берут с поверхностных и глубинных участков продукта. При иссле­довании глубинных участков образцы продукта предварительно обрабатывают спиртом и обжигают. К навескам продукта мас­сой 20 г добавляют 80 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и гомогенизируют в электрическом смесителе. Для определения общего количества микробов в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г продукта на питательный агар мето­дом пластинчатых разводок Коха, инкубируют 48 ч и подсчи­тывают число колоний. Для определения БГКП в 1 г продукта производят посев 5 мл взвеси на среду КОДА, которая является элективно-дифференциальной средой для БГКП и содержит питательный бульон, сульфанол, лактозу и бромтимоловый

синий; инкубация продолжается 18—20 ч. При росте лактозо-положительных БГКП первоначальный синий цвет меняется на темно-зеленый или ярко-желтый. Специфические измене­ния на среде КОДА не требуют дальнейшего подтверждения. Определение сальмонелл проводят в навеске продукта не менее 25 г. Делают посев разведения навески в 100 мл среды обога­щения (Мюллера, Кауфмана), инкубируют 24 ч. При наличии Proteus spp. наблюдается ползучий рост. В мазках выявляют грамотрицательные палочки, определяют их подвижность и идентифицируют культуру бактерий. Для определения коагула-зоположительных стафилококков проводят посев 0,2 мл взвеси продукта на желточно-солевой агар, инкубируют посевы при 37 °С и при комнатной температуре. При обнаружении стафи­лококков проводят их идентификацию (см. тему 12.1). Для обнаружения анаэробных спорообразующих бактерий Clostri­dium perfringens делают посев 10-кратных разведений взвеси в сульфитциклосериновую среду (СЦС) и среду Вильсона—Бле-ра. Посевы инкубируют при 46 "С в течение 12 ч; при наличии Cperfringens наблюдается почернение среды. При положитель­ном результате посева разведения Ю^-1 считается, что в 1 г продукта содержится 10 клеток соответствующих бактерий; разведения Ю^-2 — 100 клеток и т.д.

Колбасные изделия и продукты из мяса в соответствии с действующими нормативами не должны содержать БГКП (в 1 г продукта), сальмонелл (в 25 г), бактерий рода Proteus и суль-фитредуцирующих клостридий (в 0,1 г); микробное число не должно превышать 10³.

Санитарно-бактериологическое исследование консервов. При исследовании консервов определяют присутствие аэробных и анаэробных бактерий. По эпидемиологическим показаниям выявляют Clostridium botulinum и проводят исследование на наличие ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследованием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдер­живая в термостате при 37 °С в течение 5 сут, после чего моют теплой водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю крышку смоченным спиртом горящим ватным там­поном. Извлеченное из банки содержимое засевают для выяв­ления аэробной флоры в две пробирки с бульоном, а для обнаружения анаэробной микрофлоры — в две пробирки со средой Китта—Тароцци, содержащей 0,15 % агара. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 сут. При появлении призна­ков роста аэробные бактерии пересевают на питательный агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шукевичу) и на питательный агар с 1 % глюкозы. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл, вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажден­ным до 45—48 "С питательным агаром с 1 % глюкозы. После застывания на поверхность среды помещают стерильное пред-

метное стекло (для создания анаэробных условий) и посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 °С. Из выросших колоний получают чистую культуру, которую затем идентифицируют по обычной схеме.

Для выявления ботулинического токсина исследуемые про­бы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию ней­трализации токсина антитоксическими противоботулиничес-кими сыворотками типов А, В, С, Е, F на белых мышах или обнаруживают присутствие токсина с помощью других сероло­гических реакций (иммуноферментный анализ). В консервах не допускается присутствия C.botulinum и его токсина, С.рег-fringens и других патогенных бактерий.

Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указыва­ет на недостаточную эффективность примененных методов консервирования и возможность порчи. Присутствие сапро­фитных аэробных бацилл (B.subtilis, B.mesentericus) является до­пустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консерв­ных банок.

Кроме санитарно-бактериологических исследований, осу­ществляют контроль продуктов на присутствие других токсич­ных соединений: микотоксинов — зерновые культуры, кофе-бобы, сыры, овощи, фрукты; антибиотиков — мясо, птица, яй­ца, молоко; консервантов — молочные, мясные, овощные про­дукты, напитки; пестицидов — зерновые культуры, овощи, фрукты.

Тема 8.3. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

▲ План

▲ Программа

1. Особенности и основные понятия экологии микроор­ганизмов.

2. Качественные и количественные методы изучения со­става микрофлоры отдельных биотопов.

3. Значение нормальной микрофлоры в жизни человека.

4. Микробиологическое исследование при дисбактерио-зе.

▲ Демонстрация

1. Окрашенные мазки, приготовление из чистых культур бактерий, представителей облигатной микрофлоры че­ловека. Рост на скошенном агаре E.coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus epidermidis.

2. Микрофлора зубного налета.

а Задание студентам

1. Приготовить мазки из зубного налета, микроскопиро-вать и зарисовать; сделать заключение.

2. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки из чистых культур E.coli, C.perfhngens, грибов рода Can­dida.

3. По данным таблицы изучить качественный и количе­ственный состав микрофлоры отдельных биотопов.

А Методические указания

Для качественного изучения состава микрофлоры использу­ют микроскопический и микробиологический методы иссле­дования. Препараты (мазки) готовят из зубного налета, смы­вов со слизистой оболочки зева, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют (рис. 8.3.1). Из зубного налета можно приготовить прижизненные препараты ("раздавлен­ная" капля) и обнаружить подвижные микроорганизмы с помощью темнопольной или фазово-контрастной микроско­пии. Для микробиологического исследования делают смывы с кожи лица, рук и других частей тела тампоном, смоченным в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем этим же тампоном делают посев на питательные среды в чашках Пет­ри. Кроме того, отдельный тампон помещают в пробирку с глюкозопептонной средой для обнаружения БГКП (состав сре­ды см. тему 8.1).

Ориентировочно идентификацию микробов проводят по ха­рактеру выросших колоний, газообразованию на глюкозопеп­тонной среде и морфологии клеток в мазках, окрашенных по методу Грама. Для количественных посевов берут определен­ный объем исследуемого материала (например, смывы из зева) или определенную навеску (например, фекалий), разводят в изотоническом растворе хлорида натрия (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) и делают посевы со­ответствующих разведений на питательные среды: для выявле­ния гемолитических стрептококков или стафилококка — на

Рис.8.3.1. Микрофлора зубного налета.

1 — Leptotrichia spp. (L.buccalis) (Гр-удлиненные или нитевидные бакте­рии); 2 — Lactobacillus spp. (L.acido-philus, L.salivarius и др.) (Гр+ стреп-тобактерии); 3,4 — Treponema spp. (T.denticola, T.skoliodontum и др.) (Гр- нитевидные извитые бакте­рии); 5 — Streptococcus spp. (S.sali-varius, S.mitis, S.sanguis и др.) (Гр+ кокки); б - Vetlonella spp. (V.atipica и др.) (Гр- диплококки); 7 — Fuso-oacterium spp. (F.nucleatum и др.), Up-веретеновидные бактерии).

кровяной агар, для выделения E.coli — на среду Эндо, для вы­деления дрожжеподобных грибов рода Candida — на среду Са-буро. Посевы производят таким образом, чтобы получить со­считываемое количество колоний. Такие исследования повто­ряют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях состава микрофлоры в динамике заболевания (табл. 8.3.1).

Таблица 8.3.1. Состав нормальной, резидентной микрофлоры биото­пов организма человека

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

В норме не содержат микробов и являются стерильными 102_ю4 на 1 см3

Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость

Кожа — сравнительно часто встречаются: Staphylococcus epidermidis S.saprophyticus (+) А Corynebacterium spp. (+) A Streptococcus spp. (+) A Bacillus spp. (+) A Candida spp. A Pseudomonas aeruginosa (—) A

Желудочно-кишечный тракт

108 в 1 мл слюны

Полость рта — благоприятные условия для

разнообразной микрофлоры:

Streptococcus salivarius,

S. mitis, S. mutans, S.sanguis (+) A

Lactobacillus spp. (+) Ah

Bifidobacterium spp. (+) Ah

Leptotrichia buccalis (—)

Veilonella spp. (—) Ah

Bacteroides spp. (—) Ah

Candida spp. A

Treponema skoliodontum,

T.denticola (-) A

Neisseria spp. (-) A

Mycoplasma spp. A

Staphylococcus spp. (+) A

Не более 103 в 1 мл содержимого

Желудок — многие микроорганизмы погиба­ют при кислом значении рН, встречаются:

Sarcina ventriculi (+) А

Lactobacillus spp. (+) А

Candida spp. A

Около 105 в 1 мл со­держимого

Тонкая кишка — в верхних отделах кишки микрофлора представлена скудно в связи с активностью ферментов. Число микроорга­низмов постепенно нарастает в илеоцекаль-ном отделе

Продолжение

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Толстая кишка — благоприятные условия для 10¹⁰ в 1 г фекалий

разнообразной микрофлоры, выделяются с

фекалиями:

Анаэробы (в совокупности)

Bacteroides spp. (—)

Bifidobacterium spp. (+)

Lactobacillus spp. (+)

Clostridium spp. (+)

Veilonella spp. (—)
Аэробы

E.coli и др. энтеробактерии (-)

Streptococcus faecalis (+)

Bacillus spp. (+)

Конъюнктива глаза — очень часто микроор­ганизмы полностью отсутствуют, могут встре­чаться:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+.) А

Уши (наружный слуховой проход) — факуль­тативно встречаются:

Staphylococcus epidermidis (+) А

Corynebacterium spp. (+) А

Candida spp. A

Дыхательная система (верхние дыхательные пути)

Staphylococcus saprophytics (+) А

Streptococcus spp. (+) А

Klebsiella spp. (—) A

Neisseria catarralis (-) A
Candida spp. и др.

Мелкие бронхи, альвеолы и паренхима легких обычно не содержат микробов Мочеполовая система

Число микробов в со­вокупности составля­ет 1010 в 1 мл влага­лищного секрета. Со­отношение анаэробов к аэробам 10:1 Стерильна

Женские половые органы (влагалище и шей­ка матки)

(+)Ah (+)A (+)Ah

Lactobacillus spp. Corynebacterium spp. Peptococcus spp. и др.

Полость матки Мужские половые органы

(+)A (ft-) A (+)A

Mycobacterium smegmatis

Corynebacterium spp.

Staphylococcus epidermidis

Продолжение

Микрофлора биотопа

Ориентировочное содержание микробов

Дистальная треть уретры (женщин и муж­чин)

Peptostreptococcus spp. (+) Ан

Peptococcus spp. (+) Ан

Corynebacterium spp. (+) A

Mycoplasma hominis A

Staphylococcus epidermidis (+) A

Моча в почках, мочеточниках и мочевом пу- Стерильна зыре

При естественном мочеиспускании микробы Число микробов не попадают в мочу с наружного участка уретры должно превышать

10³ КОЕ/мл

Микробиологическая диагностика дисбактериоза излагается в теме 13.2.

Глава 9

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПАРАЗИТА И ХОЗЯИНА

В основе возникновения и развития инфекционного про­цесса лежит взаимодействие паразита и хозяина. Последнее включает ряд стадий, в которых микробы приобретают способ­ность вызывать патологические процессы в организме челове­ка. Патогенность (генетически детерминированная способ­ность вызывать заболевания) является полидетерминантным признаком. Каждый патогенный микроорганизм несет генети­ческую информацию об образовании различных факторов ви­рулентности. К основным факторам вирулентности следует отнести экзо- и эндотоксины, некоторые ферменты и компо­ненты микробной клетки, например реснички, капсулу и др. Выявление факторов вирулентности является важным элемен­том при индикации и идентификации микроорганизмов.

Тема 9.1. ИНФЕКЦИЯ, ПАТОГЕННОСТЬ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ МИКРОБОВ

▲ План

▲ Программа

1. Биологическое значение патогенности и вирулентности.

2. Методы экспериментального заражения и иммуниза­ции животных.

3. Бактериологическое исследование трупов павших жи­вотных.

4. Методы изучения факторов вирулентности бактерий:

а) изучение взаимодействия лиганд-рецепторного ап­
парата;

б) определение токсигенности микробов;

в) определение ферментов патогенности.

5. Особенности вирусных инфекций.

▲ Демонстрация

1. Капсула патогенных бактерий; окраска по методу Бурри—Гинса.

2. Корд-фактор Mycobacterium tuberculosis (метод Прайса); окраска по методу Циля—Нильсена.

▲ Задание студентам

1. Зарисовать демонстрируемые препараты: а) капсулу патогенных бактерий; б) корд-фактор М.tuberculosis.

2. Микроскопировать и зарисовать окрашенные метиле-новым синим мазки-отпечатки из органов белой мы­ши, павшей после заражения культурой патогенных бактерий. Определить присутствие бактерий во внут­ренних органах и тканях. Сделать заключение о форме инфекции и возможных причинах гибели животного.

3. Микроскопировать мазок со слизистой оболочки, ок­рашенный по методу Романовского—Гимзы. Найти и зарисовать "ключевые" клетки, покрытые адгезиро-ванными бактериями.

4. Микроскопировать и зарисовать мазок, демонстри­рующий явление незавершенного фагоцитоза гоно­кокков; окраска по методу Грама.

5. Учесть результаты опытов, поставленных с целью вы­явления факторов вирулентности стафилококков: ге­молизина, лецитиназы, плазмокоагулазы.

6. Определить гемолитическую активность бактериаль­ного экзотоксина (О-стрептолизина).

▲ Методические указания

Бактериоскопические методы выявления факторов вирулент­ности. Обнаружение капсулы у стрептококков (см. тему 2.2).

Выявление корд-фактора микобактерий. При выра­щивании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, вирулентные штаммы вырастают в виде переплетающихся тяжей — корд-фактор. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля—Нильсена (см. рис. 14.3.2).

Выявление адгезии бактерий. При некоторых инфек­циях бактерии в большом количестве прикрепляются к мем-

бране эпителиальных клеток. Обнаружить это явление можно с помощью микроскопических методов в мазках со слизистой оболочки пораженного органа, окрашенных по методу Рома­новского—Гимзы. Такие клетки получили название ключевых.

Выявление незавершенного фагоцитоза (см. рис. 15.2.1). При микроскопии наблюдается большое количество неразрушенных микроорганизмов, расположенных внутри про­фессиональных фагоцитов.

Определение экзоферментов и экзотоксинов — факторов па-тогенности. Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кис­лоту, которая перестает образовывать сгусток при добавлении уксусной кислоты. Для определения этого фермента в пробир­ку с субстратом (гиалуроновой кислотой) вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инку­бируют в течение 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 2—3 капли концентрированной уксусной кислоты. В пробах, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посе­вы ингибируют при 37 "С в течение 2—5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, а в контроле она остается жидкой.

Гемолизин определяют путем посева испытуемой куль­туры "бляшками" в чашки Петри с кровяным агаром. Чашки инкубируют в термостате при 37 °С в течение суток. В поло­жительном случае вокруг "бляшек" образуются прозрачные зоны гемолиза.

Определение титра гемолитической активности бактериального экзотоксина (О-стрептолизина). Из фильтрата бульонной культуры р-гемолитического стрептокок­ка готовят ряд двукратных серийных разведений. К каждому из них добавляют равный объем 5 % взвеси отмытых эритро­цитов кролика. Смесь инкубируют в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 1 ч. Параллельно инкубируют контроль­ную взвесь эритроцитов в питательном бульоне того же соста­ва. Учет результатов производят по наличию гемолиза (крас­ная, прозрачная "лаковая" кровь) или отсутствию гемолиза (осадок эритроцитов). Определяют наибольшее разведение (титр) фильтрата бульонной культуры стрептококка, при кото­ром еще наблюдается гемолиз. В дальнейшем этим разведением пользуются при определении рабочей дозы О-стрептолизина для постановки антистрептолизиновой реакции.

Лецитиназа выявляется при посеве на агар с лецитином. Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Лецитиназная проба: для быстрого обнаружения и се­рологической идентификации а-токсина клостридий — возбу­дителей газовой гангрены — в раневом отделяемом определяют

его лецитиназную активность в реакции нейтрализации с анти­сыворотками против токсинов клостридий разных видов (см. табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (раневое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в раневом отделяемом проявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соот­ветствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной. Цитотоксины. Для обнаружения некоторых бактериаль­ных токсинов, оказывающих цитопатическое действие на клет­ки (ЦПД), используют клеточные культуры. Бактерии выращи­вают в бульоне. Затем питательную среду отделяют от микро­бов и вносят в культуру чувствительных клеток. В положитель­ном случае после инкубации наблюдается характерное ЦПД. Бактериальные токсины различаются по характеру ЦПД, ко­торое может проявляться изменением формы, размеров клетки, появлением вакуолей в цитоплазме, нарушением целостности клеточного монослоя и т.д.