Анаэробные бактерии

Неспорообразующие грамотрица­тельные анаэробы

Bacteroides fragilis

и другие виды рода Bacteroides

Prevotella melaninogenica

и другие виды рода Prevotella

Porphiromonas spp.

Fusobacterium spp.

Veilonella spp.

Неспорообразующие грамположи­тельные анаэробы

Peptostreptococcus spp. Propionibacterium acnes

Спорообразующие грамположи­тельные анаэробы

Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium ramosum Clostridium sporogenes Clostridium tetani

Бактерии, перечисленные выше, вызывают гнойно-воспали­тельные процессы различной локализации, в том числе анги­ны, фурункулы, циститы и пиелиты, плевриты, перикардиты, сепсис и др. Многие из этих возбудителей встречаются в нор­мальной микрофлоре человека и проявляют свою патогенность только при нарушении нормальной экологии.

Стафилококки, стрептококки, протей, эшерихии и анаэроб­ные бактерии нередко вызывают смешанную инфекцию как в разнообразных сочетаниях между собой, так и с другими мик­роорганизмами — вирусами, грибами.

Тема 12.1. АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ -ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей гнойно-воспа­лительной и раневой инфекции, их патогенность, эко­логия, особенности инфекции и эпидемиология вы­зываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические препараты, профилактические и ле­чебные препараты.

А Демонстрация

1. Рост а- и р-гемолитических стрептококков на кровя­ном агаре.

2. Рост и образование пигмента P.aeruginosa на агаре.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

ЗАНЯТИЕ 1

▲ Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать мазки из чистых куль­тур возбудителей гнойных инфекций: S.aureus, S.pyo­genes, P.aeruginosa, E.coli, P.vulgaris. Окраска по методу Грама.

2. Микроскопировать и зарисовать мазки из гноя, содер­жащие возбудителей: стафилококков, стрептококков. Окраска по методу Грама.

3. Ознакомиться с питательными средами, применяемы­ми при микробиологической диагностике гнойных и раневых инфекций. Указать назначение отдельных пи­тательных сред.

4. Микробиологическое исследование при раневых и гнойных инфекциях:

а) указать материал, подлежащий исследованию;

б) микроскопический метод: микроскопировать мазок
из гноя, окраска по методу Грама. Сделать вывод;

в) наметить план дальнейшего исследования.

ЗАНЯТИЕ 2

▲ Задание студентам

1. Микробиологическое исследование гноя:

а) учесть результат посева гноя на кровяной агар в
чашке Петри, описать подозрительные колонии,
отметить наличие гемолиза, составить план даль­
нейшего исследования;

б) учесть результаты определения лецитиназы и плаз-
мокоагулазы у выделенной культуры стафилококка.
Сделать вывод;

в) учесть результаты определения чувствительности
культуры стафилококка к антибиотикам. Сделать
вывод.

2. Микробиологическое исследование мочи. Определить количество бактерий в 1 мл мочи по результатам ме­тода секторных посевов. Дать заключение.

3. Серодиагностика ревматизма. Ознакомиться с описа­нием стрептолизиновой реакции. Внести в протокол результаты определения анти-О-стрептолизина в сы­воротке крови больного. Сделать вывод.

4. Дать краткую характеристику демонстрируемым анти­микробным, диагностическим и лечебно-профилакти­ческим препаратам.

▲ Методические указания

Материал для исследования: раневое отделяемое, гной, экс­судат, моча, мазки со слизистых оболочек (носоглотки, зева и др.), кровь при подозрении на сепсис.

• Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 12.1.1). Из иссле­дуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие в препаратах грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздевидных скоплений (рис. 12.1.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз стафилококковой инфекции. Следует иметь в виду, что в патологическом материале стрептококки редко образуют ти­пичные скопления, чаще располагаются поодиночке или не­большими группами по 2—3 бактерии.

Бактериологическое исследование. Испытуемый материал засе­вают петлей на чашки с кровяным и желточно-солевым агаром

Рис. 1.4. Культура дрожжей Sac--charomyces cerevisiae при раз­ных методах микроскопии К с. 14. а — микроскопия мазка, окрашен­ного метиленовым синим; б - тем-нопольная микроскопия; в — фазо-во-контрастная микроскопия- г — люминесцентная микроскопия. Ок­раска корифосфином.

Рис.2.2.1. Смесь стафилококков и кишечных палочек. К с. 23. Окраска по методу Грама.

Рис.2.2.2. Возбудитель туберку­леза (Mycobacterium tuberculosis)

в мокроте. К с. 25. Окраска по методу Циля—Нильсена.

Рис.2.2.4. Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae). К с. 26.

Окраска по методу Нейссера. Вид­ны зерна волютина.

Рис.2.2.3. Споры и вегетативные

клетки возбудителя сибирской

язвы (Bacillus anthracis). К с. 25.

Окраска по методу Ожешко.

Рис.2.2.5. Капсула Klebsiellae pneumoniae. К с. 26. Окраска по методу Бурри—Гинса.

Рис.3.2.1. "Пестрый ряд". К с. 46.

а — ферментация углевода до кислоты и газа; б — отсутствие ферментации;

в — образование индола; г — образование сероводорода.

Рис.6.2. Постановка опыта специфической трансдукции (схема).Я' с. 26

пп™Ь^Г i ^dga'^{; б} ~ ^{реципиент E}-^{coli 1ас}"; ^в - Рост колоний реципиентного „» р п Т^- ^{ВДо; г} *" ^Раженная транслирующим фагом X dgal культура b.coli lac; д - рост колоний трансдуктантов (красного цвета), несу­щих ген gal, на среде Эндо.

Рис.6.1. Постановка опыта трансформации. К с. 68. контает^Спе?™г5^НК' ^в™^еленно? из B.subtilis; б - реципиент B.subtilis; в -

селенной с^Л^{ЫХ ба,СГерИЙ С ДНК; Г} ~ ^{рост колоний} Рекомбинантов на штамма н L?™ ^со_й^С1Р^ептоми«ином; д - отсутствие роста реципиентного 1мма на селективной среде со стрептомицином; е - рост колоний реципиент­ного штамма на среде без стрептомицина.

Рис.6.3. Постановка опыта по конъюгации. К с. 70. а — рост колоний бактерий донора на минимальной среде без стрептомицина; б — рост колоний рекомбинантов на селективной среде со стрептомицином без лейцина; в — рост колоний бактерий реципиентов на полной среде со стрептомицином и лейцином; г — отсутствие роста бактерий донора на среде со стрептомицином; д — донор-культура E.coli F, lei, su⁵; е — контакт между бактериями донора и реципиента; ж — реципиент-культура E.coli F", lei", st/; з — отсутствие роста бактерий реципиента на селективной среде со стрептомицином без лейцина.

Рис. 10.4.1. Кожно-аллергическая проба. К с. 144.

Рис. 12.1.2. Колонии стафилокок­ка на кровяном агаре. А'с. 162.

Рис. 12.1.1. Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes в гное. Окраска по методу Грама. К с. 160.

Рис. 12.2.1. Clostridium perfringens в отечной жидкости. К с. 174.

Рис. 13.2.1. Рост бактерий семей­ства Enterobacteriaceae на диф­ференциально-диагностических

средах. К с. 194. а — колонии Escherichia coli и Sal­monella typhi на среде Эндо; б — колонии Salmonella typhi на висмут-сульфитном агаре.

Рис. 13.3.1. Vibrio cholerae. К с. 203 Окраска по методу Грама.

Рис. 14.1.1. Streptococcus pneumo­niae в мокроте. К с. 214.

Рис. 14.2.1. Рост Corynebacteri-

um diphtheriae на кровяно-тел-

луритовой среде. К с. 231.

Рис. 14.3.2. Микрокультура My­cobacterium tuberculosis. К с. 240. Окраска по методу Циля — Нильсена.

Рис. 14.3.1. Рост Mycobacterium

tuberculosis на среде Левенштей-

на — Йенсена. К с. 239.

Рис. 15.2.1. N. gonorrhoeae в гное

из мочеиспускательного канала.

К с. 253.

Окраска фуксином.

Рис. 16.1.1. Yersinia pestis в гное

из бубона. К с. 261.

Окраска метиленовым синим.

Рис.16.1.3. Brucella melitensis (чистая культура). К с. 266.

Рис. 16.1.4. Bacillus anthracis (ма­зок из гноя). К с. 269.

Рис. 16.1.2. Francisella tularensis

(чистая культура). К с. 263.

Окраска по методу Грама.

Рис. 17.1.1. Borrelia recurrentis в

крови больного. К с. 283.

Окраска по методу Романовского -

Гимзы.

Рис. 18.1.1. Титрование вируса гриппа в РТГА с куриными эритроци­тами. К с. 292. Объяснение в тексте.

Рис.19.1.1. Тельца Бабеша —Нег-ри в нейронах гиппокампа. Срез головного мозга человека. К с. 305. Окраска по методу Романовского — Гимзы.

(ЖСА) для получения изолированных колоний. Посевы инку­бируют при 37 °С в течение суток. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза (рис. 12.1.2; на вклейке). На ЖСА S.aureus образует золотистые круглые выпуклые непрозрач­ные колонии. Вокруг колоний стафилококков, обладающих ле-цитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перла­мутровым оттенком. Для окончательного установления вида ста­филококка 2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур с последую­щим определением их дифференциальных признаков (табл. 12.1.1).

Таблица 12.1.1. Дифференциальные признаки стафилококков

Вид

S.aureus

S.sapro-phyticus

Признак

S.epider-midis

Образование:

плазмокоагулазы + — —

лецитиназы + — —

альфа-токсина + — —

Ферментация:

глюкозы + + —

маннита в анаэробных условиях + — +

Чувствительность к новобиоцину S S R

Условные обозначения:(+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; S — чувствительный; R — резистентный.

Для постановки реакции на плазмокоагулазу плазму крови, разведенную в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, вносят туда по одной петле каждой исследуемой культуры стафило­кокка и помещают в термостат при 37 °С. Через 2, 4 и 24 ч отмечают результаты опыта. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток. В некоторых случаях наряду с плазмокоагу-лазой и лецитиназой определяют фибринолизин, гиалуронидазу, ДНКазу.

Для установления источника внутрибольничной инфекции выделяют чистые культуры стафилококка от больных и бакте­рионосителей, после чего проводят их фаготипирование с по­мощью набора типовых бактериофагов. Фаги разводят до тит­ра, указанного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, высу­шивают, а затем петлей каплю соответствующего фага наносят на квадраты (по числу фагов, входящих в набор), предвари­тельно размеченные карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37 "С. Результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры (см. рис. 5.3.2).

Определение чувствительности стафилококка к антибиоти­кам — см. тему 7.2.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.

Иммунохимические исследования. Основаны на об­наружении антигенов (токсинов и ферментов) возбудителя в материале от больного с помощью чувствительных серологи­ческих реакций.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика стрептококковых инфек­ций (схема 12.1.2)

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала (за ис­ключением крови), окрашивают по методу Грама и микроско-пируют. При положительном результате обнаруживают цепоч­ки грамположительных кокков (см. рис. 12.1.1). Следует иметь в виду, что в патологическом материале стрептококки редко образуют типичные скопления, чаще располагаются поодиноч­ке или небольшими группами по 2—3 бактерии.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на кровяной агар в чашку Петри. После инкубации при 37 "С в течение 24 ч отмечают характер колоний и наличие вокруг них зон гемолиза. Из части материала, взятого из ко­лоний, готовят мазок, окрашивают по методу Грама и микро-скопируют. Для получения чистой культуры 1—3 подозритель­ные колонии пересевают в пробирки со скошенным кровяным агаром и сахарным бульоном. На кровяном агаре Streptococcus pyogenes образует мелкие, величиной с булавочную головку, мутноватые круглые колонии. В бульоне стрептококк в отличие от стафилококка дает придонно-пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, оставляя среду прозрачной.

По характеру гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на три группы: 1) негемолитические; 2) aj-гемолити­ческие, или зеленящие, образующие зеленоватую зону частич­ного гемолиза; 3) р-гемолитические, образующие вокруг коло­нии полностью прозрачную зону гемолиза.

Заключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по антигенным свойствам (табл. 12.1.2). Серогруппу стрептококков определяют в реакции преципитации с экстрактом из исследуемой культу­ры (полисахаридным преципитиногеном С) и группоспецифи-

ческими сыворотками (обычно 4 наиболее распространенные серогруппы — А, В, С и D). Развернутое серологическое иссле­дование и типирование стрептококков проводят главным об­разом для эпидемиологического обследования.

Таблица 12.1.2. Дифференциальные признаки стрептококков

Вид	Рост при	Рост на средах, содержащих	желчь (40%)
	10'С	45 °С	метиленовый синий (0,1 %)	хлорид натрия (6,5 %)

S.pyogenes — — — — —

S.pneumoniae — + ± — —

S.sanguis — ± — — +

S.salivarius — + — — —

Вид	Рост при рН 9,6	Термоустойчи­вость при 60 °С в течение 30 мин	Образование раствори­мого гемолизина	Антиген­ная груп­па (серо-группа)
	О	S

S.pyogenes — — + + А

S.pneumoniae — — + — —

S.sanguis ± H(—)

S.salivarius — — — — —(К)

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; (+) — наличие признака у одних штаммов и отсутствие его у других штаммов данного вида.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.

Иммунохимические исследования. При отдельных нозологических формах стрептококковой инфекции устанавли­вают наличие специфических антигенов в крови больного с помощью РСК, реакции преципитации и др.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Проводят при подозрении на ревматизм. Для подтверждения диагноза ревматизма определяют антитела к О-стрептолизину. Реакция основана на нейтрализации (подавле­нии) антителами, содержащимися в сыворотке крови больного, способности О-стрептолизина вызывать гемолиз. Реакцию ставят со стандартным сухим О-стрептолизином (табл. 12.1.3).

Для постановки реакции исследуемую сыворотку прогрева­ют при 56 °С в течение 30 мин и разводят фосфатным буфером

1:50, 1:250, 1:1000. Диагностический препарат О-стрептолизина также разводят буфером и применяют в количестве 0,3 мл, в котором содержится 1 рабочая доза О-стрептолизина. Рабочая доза — количество О-стрептолизина, которое почти полностью нейтрализуется половиной международной единицы анти-О-стрептолизина стандарта ГИСК. О-стрептолизин в рабочей дозе должен вызывать полный лизис 0,2 мл 5 % взвеси эрит­роцитов. Разведенную сыворотку и другие ингредиенты разли­вают по пробиркам так, как указано в табл. 12.1.3, и инкуби­руют. После инкубации отмечают последнюю пробирку, в ко­торой сыворотка еще нейтрализует рабочую дозу О-стрептоли­зина (гемолиз отсутствует). Титр сыворотки выражают числом единиц анти-О-стрептолизина в 1 мл (АЕ St-О в 1 мл). В табл. 12.1.3 приведено число АЕ St-О в 1 мл сыворотки при нейтра­лизации О-стрептолизина различными разведениями сыворот­ки. Титр анти-О-стрептолизина до 250 АЕ St-О обнаруживается у практически здоровых людей. При ревматизме с первых дней болезни антитела к О-стрептолизину выявляются в вы­соких титрах — 500 АЕ St-О и выше.

• Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных грамотрицательными аэробными бактериями

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого мате­риала (гной, раневое отделяемое, участки ожоговой ткани и др.) готовят мазки, окрашивают по методу Грама и микроско-пируют. Обнаружение в мазках грамотрицательных бактерий позволяет сделать предварительное заключение.

Бактериологическое исследование. Для выделения культуры Pseudomonas aeruginosa исследуемый материал засевают в чашки Петри на основные (МПА) или селективные питательные среды (агар, содержащий цитилпиридиний хлорид, который угнетает рост сопутствующей микрофлоры — ЦПХ-агар). По­севы инкубируют при 37 °С в течение суток. P.aeruginosa обра­зуют круглые плоские слизистые колонии, окрашивая среду характерным сине-зеленым пигментом. При бактериоскопии темнопольным методом нативных препаратов, приготовленных из колоний, в "раздавленной" или "висячей" капле обнаружи­вают подвижные и слегка изогнутые палочки; в мазках, окра­шенных по методу Грама, — грамотрицательные палочки. Чис­тые культуры P.aeruginosa идентифицируют по биохимическим признакам и образованию пигмента.

Для эпидемиологического анализа госпитальных инфекций определяют серовары в реакции агглютинации, пиоциновары и фаговары.

Для выделения энтеробактерий исследуемый материал засе-

вают на одну из дифференциально-диагностических сред, на­пример на среду Эндо (см. тему 3.1). Для выделения бактерий рода Proteus используют метод Шукевича (см. тему 3.1).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Патогенные штаммы P.aerugi­nosa выделяют различные растворимые белковые (экзотокси­ны и экзоферменты) и небелковые (экстрацеллюлярная слизь) антигены, которые могут быть обнаружены в материале от пациента (из очага, в крови или моче) с помощью чувстви­тельных серологических реакций (ИФА и др.).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика сепсиса

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь; при септико-пиемиях исследуют также материал из первичных и вторичных местных очагов инфекции. Кровь берут в период подъема температуры до начала антибиотикотерапии из локтевой вены в количестве не менее 10 мл у взрослых и 5 мл у детей, так как микроорганизмы находятся в крови в сравнительно не­больших количествах. Посевы делают у постели больного в колбы с 50—100 мл питательной среды. Сравнительно большие объемы питательной среды (в 10 раз превышающие количество крови) необходимы для устранения бактерицидного действия сывороточных белков.

В случае необходимости транспортировки крови к ней до­бавляют антикоагулянты: цитрат или оксалат натрия, декстран сульфат, гепарин. В качестве добавки к среде для выделения бактерий из крови используют полианетолсульфонат натрия, являющийся антикоагулянтом и одновременно угнетающий бактерицидную активность сыворотки, фагоцитоз, инактиви-рующий комплемент и нейтрализующий лизоцим.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Является ведущим при ла­бораторной диагностике сепсиса. Посевы производят на жид­кие среды обогащения: сахарный бульон и др.; при подозрении на анаэробную флору — на тиогликолевую среду, среду Китта— Тароцци или другие элективные среды для анаэробов (см. тему 3.1) и инкубируют их при 37 °С в течение 10 дней при еже­дневном контроле. В случае отсутствия роста микроорганизмов дают отрицательный ответ. При наличии роста делают мазки, которые окрашивают по методу Грама. Выделенную чистую

культуру микроорганизмов идентифицируют и определяют ее чувствительность к антибиотикам.

При оценке результатов необходимо исходить из того, что сепсис является тяжелым общим инфекционным заболеванием, развивающимся в условиях резкого угнетения всех основных механизмов иммунитета. Возбудителями сепсиса являются раз­личные патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Однократный посев крови- при сепсисе не всегда приводит к выделению культуры. Более информативным является трех­кратный посев крови с суточным интервалом. На фоне анти­биотикотерапии кровь у больных для посева следует брать 5—6 раз.

• Микробиологическое исследование мочи

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мочу собирают в объ­еме 3—5 мл при естественном мочеиспускании (средняя пор­ция) или путем катетеризации. Микробиологическое исследо­вание начинают не позднее Ь^2_3. после взятия мочи, так как находящиеся в ней микроорганизмы быстро размножаются при комнатной температуре; допускается хранение мочи в холо­дильнике не более 1 сут.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Бактериологическое исследование. Используют количествен­ный метод секторных посевов, позволяющий определить степень бактериурии — число микробных клеток в 1 мл мочи. Посев мочи делают на чашку Петри с питательным агаром с помощью стан­дартной бактериологической петли. Вначале делают 30—40 штри­хов в секторе А, затем прожигают петлю и делают 4 штриховых посева из сектора А в сектор I и таким же способом из I сектора во И, из II — в III сектор (рис. 12.1.3). Чашки инку­бируют в течение суток при 37 °С, подсчитывают число вырос­ших колоний и определяют степень бактериурии (табл. 12.1.4).

Рис.12.1.3. Секторные посе­вы для количественного оп­ределения бактерий в моче. Объяснение в тексте.

Число колоний в секторах	Количество бактерий в 1 мл мочи
А	I	II	III

Таблица 12.1.4. Определение степени бактериурии методом секторных посевов

1—6 — — — Менее 103

8-20 - - - З'Ю³

20-30 - - - 5-Ю³

30-60 - - - 10⁴

70-80 - - - 5-Ю⁴

100-150 5-10 - - 10⁵

Несосчитываемое 20—30 — — 5-Ю⁵

Несосчитываемое 40—60 — — 10⁶

Несосчитываемое 100-140 10—20 - 5-Ю⁶

Несосчитываемое Несосчи- 30—40 — 10⁷

тываемое

Несосчитываемое То же 60—80 Единичные 10⁸

колонии

Степень бактериурии 10⁵ микробных клеток и выше в 1 мл мочи указывает на воспалительный процесс. Показатель 10³ микробных клеток в 1 мл мочи свидетельствует об отсутствии воспалительного процесса и обычно связан с контаминацией мочи. Степень бактериурии 10⁴ расценивают как сомнитель­ный результат, исследование необходимо повторить.

Параллельно с количественным учетом изучают выросшие колонии, выделяют и идентифицируют чистые культуры бак­терий, определяют их чувствительность к антибиотикам. Ко­личественное определение степени бактериурии имеет важное диагностическое значение и является одним из критериев эф­фективности антибактериальной терапии.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Стафилококковый анатоксин (очищенный и адсорбирован­ный). Получают из нативного токсина путем его обезврежива­ния и осаждения трихлоруксусной кислотой с дополнительной очисткой этиловым спиртом и адсорбцией на гидрате оксида алюминия. Обладает высокими иммуногенными свойствами. Применяют для активной иммунизации с целью профилактики стафилококковых инфекций и для лечения стафилококковых заболеваний.

Стафилококковая вакцина. Взвесь коагулазоположительных золотистых стафилококков, инактивированных нагреванием. При­меняют с целью лечения при длительно и вяло текущих ста­филококковых заболеваниях. Чаще используют аутовакцину.

Иммуноглобулин человеческий противостафилококковый.

Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковый антитоксин. Готовят из крови животных или людей, иммунизированных стафилококковым адсорбирован­ным анатоксином. Применяют для специфического лечения при стафилококковых заболеваниях.

Стафилококковый бактериофаг (жидкий). Фильтрат фаголи-зата стафилококков. Применяют наружно, внутрикожно, внут­римышечно для лечения при стафилококковых заболеваниях.

Диагностические стафилококковые фаги. Набор типоспеци-фических фагов для фаготипирования стафилококков.

О-стрептолизин сухой. Лиофильно высушенный фильтрат бульонной культуры стрептококка — активного продуцента О-стрептолизина. Применяют для серодиагностики — опреде­ления антител к О-стрептолизину в сыворотках крови больных стрептококковыми инфекциями (чаще ревматизмом).

Антибиотики. Грамположительные бактерии — р-лак-тамные антибиотики, ванкомицин, тетрациклины, аминогли-козиды, макролиды, линкомицины, сульфаниламиды, фторхи-нолоны и др.

Грамотрицательные бактерии — р-лактамы, спектр действия которых сдвинут в сторону грамотрицательных мик­роорганизмов, хлорамфеникол, аминогликозиды, тетрацикли­ны, сульфаниламиды, фторхинолоны и др.

Тема 12.2. АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей анаэробных гнойно-воспалительных и раневых инфекций, их па-тогенность, экология, особенности инфекций и эпи­демиология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика гнойных заболева­ний, вызванных неспорообразующими анаэробами.

3. Микробиологическая диагностика газовой гангрены.

4. Микробиологическая диагностика столбняка.

5. Биохимические и молекулярно-биологические методы диагностики анаэробной инфекции.

6. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Демонстрация

1. Мазки из чистых культур Clostridium perfringens, С. teta-ni, Bacteroides fragilis. Мазки из раневого отделяемого, содержащие смешанную микрофлору (клостридии, ста­филококки, грамотрицательные бактерии и др.).

2. Методика посева для выделения патогенных анаэробов.

3. Аппаратура и питательные среды для выращивания анаэробов.

4. Определение ct-токсина клостридий в раневом отделя­емом с помощью летициназной пробы.

а Задания для выполнения лабораторной работы

1. Бактериоскопическое исследование: приготовить маз­ки из гноя, окрасить их по методу Грама и микроско-пировать. Сделать предварительное заключение и на­метить ход дальнейшего исследования.

2. Сделать окончательное заключение о возбудителе или возбудителях раневой инфекции на основании бакте-риоскопических, бактериологических и других дан­ных, полученных из бактериологической лаборатории.

▲ Методические указания

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной, раневое отде­ляемое, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал и др., кровь — при сепсисе. Для обеспечения бескислородных условий взятие материала производят шприцем с хорошо при­тертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирку со смесью инертных газов (N₂ + Н₂) и С0₂, и вводят в нее исследуемый материал, кото­рый изучают в микробиологической лаборатории. Используют также различные специальные транспортные среды, в которые помещают материал, взятый у больных.

• Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из очага, кровь — при сепсисе.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (см. схему 12.1.1). Из ис­следуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие в препаратах бактерий позволяет поставить ориентировочный диагноз и наметить план дальней­шего исследования.

Бактериологическое исследование. Посевы производят на элек­тивные обогатительные среды для анаэробов (среда Китта—Та-роцци, тиогликолевый бульон или полужидкий тиогликолевый агар), содержащие специальные добавки (гемин, витамин К и др.), и инкубируют при 37 °С в течение 24—48 ч. После про­смотра выросшей культуры делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. Бактериоскопия дает воз­можность установить однородность или неоднородность куль-

туры, а по морфологии клеток и тинкториальным свойствам ориентировочно отнести ее к определенному роду. Для полу­чения чистой культуры делают пересевы на плотные среды в чашки Петри и инкубируют в анаэробных условиях 3—4 сут до формирования изолированных колоний. После изучения колоний их пересевают на элективные среды. Идентификацию выделенной чистой культуры производят на основании прису­щих ей дифференциальных признаков, которые определяют также в строго анаэробных условиях (табл. 12.2.1).

Таблица 12.2.1. Дифференциальные признаки неспорообразующих и спорообразующих анаэробных бактерий

Признак				Бактерии
	Рер-	Рер-	Veil-	Вас-	C.per-	C.no-	C.se-	C.so-	C.hi-
	to-	tost-	lone l-	teroi-	frin-	vy	pti-	rdel-	stoty-
	сос- CUS	repto-сос-cus	la	des	gens		cum	li	ticum

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; х — непостоянный признак; (+) — отсутствие признака у большинства штаммов; (±) — наличие признака у большинства штаммов; с — слабая ферментация.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследова­ния. Анаэробные бактерии вырабатывают специфические ме­таболиты, включая летучие жирные кислоты с короткой цепью, спирты и нелетучие органические кислоты. Для их обнаруже­ния в материале от больного используют ГЖХ (см. главу 11).

• Микробиологическая диагностика раневой анаэробной кло-стридиалъной инфекции — газовая гангрена (схема 12.2.1).

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участ­ков очага поражения, особенно из глубоких слоев. Кровь — при сепсисе.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Проводят путем микро­скопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных (1—1,5x3—10 мкм) грамположительных палочек, некоторые из которых (C.perfringens) образуют макрокапсулу (рис. 12.2.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал вно­сят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, железо-сульфитным агаром (среда Вильсона—Блера) и молоком. Часть пробирок прогревают при 80 "С в течение 30 мин для уничто­жения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют в обычном термостате при 37 "С. C.perfringens растет в глубине среды. В молоке уже через 3—4 ч посева образуется губкооб-разный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделившуюся прозрачную жидкость. Через сутки на среде Китта—Тароцци отмечается помутнение и газообразование, а на железосуль-фитном агаре несколько позднее появляются черные колонии в глубине агарового столбика. Для получения культур других видов клостридий требуются более строгие анаэробные усло­вия. Из всех посевов делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При положительном результате обнаруживаются крупные грамположительные палочки.

Для получения чистой культуры делают пересевы на сахар­ный кровяной агар в чашки Петри и инкубируют в строго анаэробных условиях при 37 °С в течение 3—4 дней. Выросшие колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци. Идентификацию чистой культуры производят на основании признаков, перечисленных в табл. 12.2.1. Идентификация по биохимическим признакам осуществляется традиционными методами или с помощью тест-систем для определения специ­фических бактериальных ферментов или метаболитов.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Лецитиназная проба: для бы­строго обнаружения и серологической идентификации а-токсина клостридий в раневом отделяемом определяют его лецитиназ-ную активность в реакции нейтрализации (РН) с моновалент­ными антисыворотками против токсинов клостридий разных видов (табл. 12.2.2). С этой целью исследуемый материал (ра­невое отделяемое) помещают в пробирки с раствором лецитина и добавляют антисыворотки. Присутствие лецитиназы в ране­вом отделяемом выявляется помутнением жидкости в пробирке. При нейтрализации лецитиназной активности токсина соответ­ствующей антисывороткой жидкость остается прозрачной.

Таблица 12.2.2. Постановка лецитиназной пробы для определения и идентификации токсинов клостридий в РН (форма протокола)

Реагент	Количество реагента, мл
	пробирка	пробирка	пробирка	пробирка
Исследуемый материал 0,3	0,3 0,3 0,3
Лецитин 0,1	0,1 0,1 -
Раствор хлорида натрия 0,1	0,2
Сыворотка анти- C.perfringens —	0,1
Сыворотка анти- С. novy —	0,1
Инкубация при 37 "С в течение 46—60 мин
Учет результатов (наличие
помутнения)

Примечание. При учете результатов используют обозначения: (+) — наличие помутнения; (—) — отсутствие помутнения.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

ГЖХ используют для обнаружения в материале от больного специфических метаболитов клостридий, включая летучие жирные кислоты с короткой цепью, спирты и нелетучие орга­нические кислоты (см. главу 11).

Биопроба. Для серологической идентификации токсинов также можно использовать биопробу. Проводят РН токсина на лабораторных животных. С этой целью смесь исследуемого токсина с моновалентными антитоксическими сыворотками (к токсинам C.perfringens или других видов клостридий) вводят подкожно морской свинке. В случае нейтрализации токсина животное выживает; при отрицательной реакции морская свинка погибает через 30 мин — 4ч после инъекции.

• Микробиологическая диагностика столбняка (см. схему 12.2.1)

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кусочки ткани вокруг предполагаемых входных ворот инфекции, перевязочный ма­териал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участ­ков очага поражения, особенно из глубоких слоев. При подо­зрении на столбняк у женщин после родов или аборта — вы­деления из матки, у новорожденных — выделения из пупочной раны.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду Китта—Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при 37 °С в течение 3—4 сут, наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в чашки Петри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. Посевы также инкубируют в анаэробных условиях. На поверхности кровяного агара C.tetani образует нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные колонии пересевают в про­бирки со средой Китта—Тароцци и сохраняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе, заполненном смесью инертных газов. Для определения способности выделенной чистой культуры к образованию столбнячного токсина (токси-генности) используют серологические реакции (преципитации в геле и др.) с антителами к тетаноспазмину. Бактериологичес­кий метод используют в качестве дополнительного метода для подтверждения диагноза, поскольку он не дает своевременного результата.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Токсин в материале может быть обнаружен с помощью серологических реакций in vitro (ИФА и др.). Метод позволяет получить ответ в течение нескольких часов и обеспечивает своевременную диагности­ку заболевания.

Биопроба. Проводят для обнаружения столбнячного токсина в исследуемом материале. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают изотоническим раство­ром хлорида натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вводят внутримышечно бе­лым мышам. Животным контрольной группы вводят смесь фильтрата с антитоксической сывороткой. Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и задних конеч­ностей. В результате резкого сокращения хвостовых мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные животные погибают. У животных в контрольной группе признаки инток-

Эшерихиоз Шигеллез (бактериальная ди­зентерия)

»

сикации отсутствуют вследствие нейтрализации токсина анти­сывороткой. В настоящее время биопроба практически не при­меняется.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Антитоксические противогангренозные сыворотки — монова­лентные (антиперфрингенс, антиэдематиенс — антинови, анти-септикум и др.) и поливалентная. Сыворотки получают путем иммунизации лошадей соответствующими анатоксинами, с по­следующей очисткой и концентрацией методом ферментатив­ного гидролиза (диаферм-3). Препараты выпускаются в жид­ком и сухом виде. Применяют для экстренной пассивной про­филактики и специфической иммунотерапии газовой гангрены.

Адсорбированный столбнячный анатоксин. Получен путем обезвреживания формалином столбнячного токсина с после­дующей его очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате оксида алюминия. Входит в состав ассоциированной коклюш-но-дифтерийно-столбнячной вакцины и других препаратов. Применяют для активной иммунизации против столбняка.

Противостолбнячная сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином. Очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность измеряет­ся в международных единицах. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.

Иммуноглобулин человеческий противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции крови доноров, ревакциниро-ванных очищенным адсорбированным столбнячным анатокси­ном. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.

Антибиотики. Грамположительные бактерии — р-лактамные антибиотики, ванкомицин, тетрациклины, макро-лиды, линкомицины, метронидазол.

Грамотрицательные бактерии — р-лактамы, спектр действия которых сдвинут в сторону грамотрицательных мик­роорганизмов, хлорамфеникол, тетрациклины, сульфанилами­ды, метронидазол.

Аминогликозиды и фторхинолоны, как правило, не активны по отношению к анаэробным микробам.

Глава 13