Постановка реакции для определения «золотого числа»

Обязательным этапом конструирования иммунохротографических тест-систем является определение «золотого числа», т.е. минимального защитного количества гидрофильного полимера, способного адсорбироваться на поверхности 10 мл золя золота и предотвращать его коагуляцию при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Оценка адсорбционной способности также может характеризовать кондиционность приготовленных наночастиц коллоидного золота [1].

При постановке реакции использовали серии КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 и МкАт 1811 и 387 («Биалекса», Россия) с концентрацией белка 4,5 мг×см^-3 и 8,0 мг×см^-3 соответственно. Разведения антител и постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных полистероловых планшетах на наиболее часто используемом для этих целей, по данным литературы, 0,005 М карбанатно-бикарбонатном буфере [….].

(15) Постановка реакции. Для постановки реакции с целью определения золотого числа (ЗЧ) использовали два планшета: планшет № 1 – определение ЗЧ для МкАт 1811, планшет № 2 – определение ЗЧ для МкАт 387. Реакцию с каждой серией КЗ ставили в 2 повторностях.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре.

(16) При визуальной оценке за «золотое число» принимали концентрацию антител в лунке, имеющей стабильную розовую окраску (где отсутствовало изменение цвета с розового на голубой-синий). фото

(17) Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 и 387 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1.

Серия КЗ	Золотое число для МкАТ 1811 / 387 определено в лунке (1) и соответствует концентрации МкАт (2), мкг·см-3
		3,125		12,5
10/1		6,25		25,0
		3,125		12,5
12/1		6,25		25,0

(18) Кроме визуального определения «золотого числа» оценивали оптическую плотность содержимого лунок на планшетном спектрофотометре, измеряя ее при длине волны λ = 630 нм. По результатам определения строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител.

На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3).

концентрация МкАТ, мкг·см-3

Рис. 1 – Результаты определения «золотого числа» для МкАт 387 и 1811 с серией КЗ № 10/1 при постановке реакции на 0,005 М КББ.

Из данных, представленных на рисунке 1, следует, что точка выхода на плато соответствует концентрация МкАт: для МкАт 1811 – 3,125 мкг·см^-3 , для МкАТ 387 – 12,5 мкг·см^-3.

По результатам визуальной оценки и спектрофотометрии были определены серии КЗ с наибольшей адсорбционной способностью – №10/1 и 12/1, а также выбраны МкАт 387 для последующей посадки на наночастицы КЗ соответствующих серий препаратов.

(19) Для МкАт 387 был выбран диапазон концентраций антител от
25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 , в пределах которого провели раститровку антител с шагом 2 мкг·см^-3 с целью определения более точного значения концентрации антител для приготовления конъюгата с КЗ.

Приготовление концентраций МкАт отличающихся друг от друга на
2 мкг·см^-3 в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 проводили в эппендорфах в объеме, необходимом для постановки реакции с сериями КЗ № 10/1 и 12/1.

Далее проводили постановку реакции с целью определения «золотого числа» в планшетах.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре, измеряя спектр содержимого лунок планшета при длине волны λ = 630 нм.

По результатам спектрофотометрии строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител. На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3). Золотое число определяли как х + 15% [87].

концентрация МкАТ, мкг·см-3

Рис. 2 – Зависимость спектра поглощения от концентрации МкАТ при длине волны 630 нм при титровании антител в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 12,5 мкг·см^-3 с интервалом 2 мкг·см^-3.

Из данных, представленных на рисунке 2, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует
19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] необходимая концентрация для конъюгации соответствующих антител должна составлять плюс 15 % к концентрации, определенной по результатам оценки «золотого числа», соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

(20) В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм.

Для получения кондиционного коллоидного золота с размером частиц 30 нм необходимо:

1) приготовить 50 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия: 0,69 г 5,5-водного цитрата натрия растворить в 50 мл деионизированной воды;

2) приготовить 10% раствор золохлористоводородной кислоты (HAuCl₄·3H₂O): к 1 г HAuCl₄ добавить 10 мл деионизированной воды;

3) в колбу Эрленмейера добавить 50 мл деионизированной воды и поместить магнитную мешалку. Надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300^◦С;

4) через 6 мин (по отработанной в дипломной работе методике – время от момента постановки колбы с содержимым на плитку до начала стекания конденсата) внести 0,058 мл 10% раствора КЗ [1], кипятить 2 мин;

5) внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия;

6) при изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ^◦С;

7) кипятить раствор еще 20 мин;

8) выключить магнитную плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре и оставить до следующего дня с целью оценки на наличие осадка. Хранить в холодильнике при 4 ^оС.

(21) С использованием отработанной по результатам данной работы методики для дальнейшего применения с целью разработки иммунохроматографической тест-системы для выявления H.pylori рекомендованы серии КЗ №10/1 и 12/1. Характеристика препаратов КЗ серий № 10/1 и 12/1 представлена в таблице 4.

Таблица 4 – Характеристики препаратов КЗ серий 10/1 и 12/1

Признак	КЗ №10/1	КЗ №12/1
Диаметр частиц коллоидного золота (dср) по данным электронной микроскопии, нм	26,7
Форма	Овальная, круглая	Овальная, круглая
Однородность	Однородные	Однородные
Наличие конгломератов	-	-
Результаты спектрофотометрии: оптическая плотность (ЕД), max пика поглощения; длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ=200-600 нм	1,020 max при λ=526	0,867 max при λ=525
Диаметр частиц коллоидного золота (dср), определенный по результатам спектрофотометрии, нм [ ]		20-30

(22) Для получения конъюгата с вышеуказанными сериями КЗ рекомендованы МкАт 387. Из данных, представленных в данной работе, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует 19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] рекомендуемая концентрация антител для конъюгации с сериями КЗ № 10/1 и 12/1 составляет, соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

(23) Таким образом, для получения одного из наиболее важных иммунохимических компонентов иммунохроматографической тест-системы (конъюгата КЗ с антителами), предназначенной для выявления Helicobacter pylori, был проведен ряд последовательных экспериментальных исследований по отработке условий синтеза сферических, однородных частиц коллоидного золота размером 30 нм, наиболее оптимальных по данным литературы для приготовления конъюгата с антителами. Путем постановки «золотого числа» была определена оптимальная концентрация выбранных моноклональных антител для последующей конъюгации с экспериментально обоснованными кондиционными сериями препаратов коллоидного золота, которые были получены по разработанной в дипломной работе методике.

(23) По результатам данной работы можно сделать следующие выводы:

– Теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм;

– при отработке методики приготовления наночастиц КЗ с заданным размером экспериментально получено 12 серий препарата;

– с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии проведена оценка полученных серий КЗ и выбраны наиболее кондиционные по данному этапу исследования серии КЗ № 10, № 10/1, № 12, № 12/1 с размером частиц от 15 до 30 нм;

– с помощью постановки реакции по определению «золотого числа» проведена оценка адсорбционной способности четырех серий КЗ с выбранными для разработки иммунохроматографической тест-системы МкАт к Сag белку H.pylori – МкАт 1811 и МкАт 387;

– теоретически и экспериментально обоснован состав конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H.pylori: серии коллоидного золота 10/1 и 12/1 и МкАт к Сag белку H.pylori клон 387 с концентрацией, соответственно, 17 мкг·см^-3 и 19 мкг·см^-3.

(24) Исходя из вышесказанного, можно сделать следующие практические предложения:

1 Рекомендовать применение предложенной схемы синтеза наночастиц КЗ для использования из в составе конъюгата с антителами для разработки ИХ тест-системы, предназначенной для идентификации H. pylori.

2 Подготовить статью для публикации в научно-практическом журнале.

(25) Результаты работы были опубликованы в виде тезисов на Всерос-сийской научной конференции «Наука – производство – технологии – экология» в апреле 2015 г.

(26) Автор выражает глубокую благодарность своему дипломному руководителю д.м.н., доценту кафедры микробиологии Богачевой Н.В. и магистранту кафедры микробиологии Мокрецовой И. В. за помощь в выполнении дипломной работы.