В.Измерение токов одиночного канала

Для измерения ионных токов через одиночные каналы был разработан специальный метод, который получил называние пэтч-кламп (patch-clamp) (рис. 10). Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки (микроэлектрода) с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки (рис. 10А). При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембраной и стеклом пипетки создается сопротивление больше 10⁹ Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт»). Когда пипетка соединена с усилителем и осциллографом, можно зарегистрировать небольшие токи, проходящие через участок мембраны, находящийся внутри кончика пипетки. Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется «cell attached» (клетка присоединена). Достигнув контакта с клеткой, можно, отводя микропипетку, оттянуть участок мембраны и оторвать его для формирования «inside-out» (внутренняя сторона наружу) конфигурации. В последнем случае цитоплазматическая сторона мембраны будет обращена к раствору, в котором находится клетка. Кроме этого, из конфигурации «cell attached» с помощью небольшого дополнительного присасывания можно прорвать участок мембраны расположенный внутри регистрирующего электрода, обеспечив контакт последнего с цитоплазмой клетки. В этих условиях будут реги­стрироваться токи в конфигурации «whole-cell» (целая клетка). И, наконец, после получения конфигурации «целая клетка», можно оттянуть электрод от клетки, сформировав из мембраны

Рис. 10. Регистрация ионных токов через одиночные каналы мето­дом пэтч-кламп

(А) Принцип метода. Тонкая стеклянная пипетка образует плотный контакт с мембраной (1), который благодаря легкому понижению давления превращает­ся в гигаомный контакт (2). Оттягивание мембраны с последующим отрывом ее фраг­мента приводит к конфигурации inside-out (3). Другой вариант основан на последова­тельном образовании конфигурации «whole cell» (целая клетка) и затем — «outside-out» (4). (Б) Регистрация токов отдельных ионных каналов. Пипетка с оторванным участком мембраны клетки помещается в раствор. Токи текущие через одиночный канал усиливаются и регистрируются с помощью осциллографа. (В) Пример токов одиночных ионных каналов, зарегистрированных методом пэтч-кламп. Видно, что каналы быстро открываются и закрываются. Время открытого состояния канала колеблется вокруг определенного среднего значения.

сначала тонкую перемычку, а затем, после отделения этого участка, получить конфигурацию «outside-out» (наружная сторона наружу). Каждая из этих конфигураций имеет свои преимущества. Их использование зависит от типа изучаемого ионного канала и той информации, которую мы хотим получить в данном эксперименте. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов (рис. 10 Б, В).

Пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне малые токи. В результате мы имеем возможность точного измерения амплитуд токов одиночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики их работы. Метод позволяет как угодно менять потенциалы на мембране, а также ионный состав и растворы как с наружной, так и внутренней стороны мембраны. В 1991 г. за изобретение этого метода и описание работы одиночных ионных каналов известным физиологам Эрвину Нейеру и Берту Сакману была присуждена Нобелевская премия (рис. 11).

Рис 11. Лауреаты Нобелевской премии 1991 года Э. Нейер и Б. Сакман