Метод совместного определения гистамина и серотонина

Принцип метода: Гистамин содержится в лейкоцитах, серотонин – в тромбоцитах, поэтому оба вещества определяют в цельной крови после осаждения белков хлорной кислотой. Анализ завершается измерением флюоресценции продуктов конденсации гистамина с ортофталиевым альдегидом, а серотонина с нингидридом.

Реактивы:

1. Калия оксалат, раствор 13,4 г/л.

2. Хлорная кислота (НСIО₄), 1Н раствор.

3. Натр едкий, растворы 1Н и 5Н.

4. Натр едкий, 0,1Н раствор, насыщенный поваренной солью. К 0,1Н NaOH добавляют кристаллы поваренной соли в таком количестве, чтобы на дне все время был осадок.

5. Натрия хлорид.

6. HCI, 0,1 н раствор.

7. Фосфатный буфер рН 8,0, концентрации 1/15 моль/л.

8. Хлороформ.

9. Бутиловый спирт нормальный (п-бутанол).

10. Бутанол- хлороформенная смесь. Смешивают 150 мл п-бутанола и 100 мл хлороформа.

11. Кислота фосфорная, 1,5 моль/л: 17,3 мл доводят до 100 мл.

12. Ортофталиевый альдегид, раствор 1 г/л в абсолютном метаноле.

13. Нингидрид, раствор 100 ммоль/л. Растворяют 180 мг нингидрина в 10 мл воды.

14. Калибровочные растворы гистамина и нингидрина, содержащие по 100 мг/л в 0,01Н HCI.

Ход определения: При взятии крови добавляют 1,34%-ный раствор оксалата натрия. К 1 мл крови приливают 1 мл воды и 1 мл 1Н хлорной кислоты, перемешивают и через 30 мин центрифугируют. К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 5Н NaOH, 1 г порошка хлорида натрия и 4 мл бутанол-хлороформенной смеси, встряхивают 3 мин, а затем центрифугируют для разделения слоев. Водную фазу удаляют, а к органической добавляют 2 мл 0,1Н NaOH, насыщенного хлоридом натрия, встряхивают и центрифугируют, 3,5 мл органической фазы переносят в другие пробирки, где экстрагируют 2,5 мл 0,1Н HCI. После разделения фаз из кислотной (верхней) фазы отбирают порции по 1 мл, которые используют для определения гистамина и серотонина.

Для определения гистамина к 1 мл кислотной фазы добавляют 0,2 мл 1Н NaOH и 0,1 мл раствора ортофталиевого альдегида в метаноле. Через 4 мин приливают 0,1 мл 1,5 М фосфорной кислоты, доводят объем до 5 мл и измеряют флюоресценцию при длине волны 470 нм.

Для определения серотонина к 1 мл кислотной фазы добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 8,0 и 0,2 мл 0,1М раствора нингидрина. Смесь инкубируют 30 мин при 75 °С, затем еще 1 ч. Выдерживают при комнатной температуре, доводят объем до 5 мл и измеряют флюоресценцию в области 490 нм.

Для калибровки берут пробы, содержащие 0,05 и 0,1 мкг серотонина и гистамина соответственно, доводят водой до объема 1,5 мл и приливают 0,5 мл 1Н хлорной кислоты. В холостой опыт берут 1,5 мл воды и 0,5 мл 1Н хлорной кислоты. Калибровочную и холостую пробы экстрагируют бутанол-хлороформенной смесью после добавления 0,2 мл 5Н NaOH и обрабатывают так же, как и опытные пробы. Свечение холостой пробы вычитают из результатов, полученных для опытных и калибровочных проб.

Расчет проводят по калибровочному графику, по данным которого рассчитывают содержание гистамина или серотонина в пробе. Чтобы узнать содержание в 1 мл цельной крови, полученные результаты умножают на 3/2, так как в опыт взято 2 мл хлорного экстракта крови из общего объема 3 мл.