Відомо, що продуцентами амілаз є мік-роміцети (Aspergillus, Penicillium, Mucor) І бактерії (Bacillus). Дані щодо деяких їхніх фізико-хімічних властивостей наведено в табл. 2.
Дослідження α-амілаз А. Flavus, A. Awa-Mori Та A. Oryzae [17] показало, що вони характеризувались однаковими значеннями рН-оптимумів активності 5,0–5,25; зона їхньої рН-стабільності — 6,0–8,0; точка найбільшої стійкості — 7,0. Усі три α-амілази стабільні при кімнатній температурі, утім фермент А. Flavus Був стійкішим до нагрівання, ніж A. Awamori Та A. Oryzae, і при 55 0С протягом 1 год зберігав 70% вихідної активності. Температурний оптимум α-амілази А. Flavus — 50 0С, а α-амілаз A. Awamori Та A. Oryzae — 40 0С. Стабільність досліджуваних ферментів до теплової денатурації підвищувалась у присутності субстрату (крохмалю). Галогеніди у концентрації 0,25 М не стабілізували α-амілази, а навпаки, прискорювали їх інактивацію. Цей вплив зростав у послідовності Cl– < Br– < F– < I– і притаманний усім трьом ферментам. Сечовина концентрацією від 1,0 до 6,0 М денатурувала білки. Інактивуюча дія була більш вираженою для α-амілаз A. аWamori Та A. Oryzae, стійкішим був фермент із А. Flavus. ЕДТА — сильний інгібітор усіх трьох α-амілаз, а атоми кальцію — важливі для їхньої активності й стабільності.
Оскільки мікробна конверсія крохмалю і дотепер залишається одним із важливих напрямів досліджень у біотехнології, для удосконалення біотехнологічних процесів необхідним є пошук високоефективних амі-лолітичних ферментів з новими властивостями. Так, автори [18] із 245 штамів морських грибів відібрали перспективний продуцент позаклітинних амілаз — Aspergillus Flavipes І показали, що залежно від умов культивування він здатен продукувати різні амілолі-тичні комплекси. На живильному середовищі, яке містить пептон і дріжджовий екстракт (рН 7,0), A. Flavipes Синтезував три форми амілази, які відрізнялись оптимумом рН. Зміна початкового значення рН середовища (8,6) або видалення з живильного середовища пептона супроводжувалось утворенням однієї з форм ферменту. Присутність протеолітичних ферментів знижувала активність ізольованих форм амілаз. У разі внесення в живильне середовище інгібітору протеаз діізопропілфторфосфату синтезувалась нова форма амілази з оптимумом рН 5,5 та 7,5, максимальною активністю при 60–80 0С і високою стабільністю. Амілаза 1 виявляла активність у широкому діапазоні значень рН (5,5–8,0), оскільки становила суміш двох молекулярних форм: кислої (м. м. 50 кДа, оптимальне значення рН 6,0, термооптимум 30–50 0С) і лужної (м. м. 14,5 кДа, оптимум рН 7,5, термооптимум 30–50 0С) амілаз. Амілаза 2 мала характерні для більшості грибних амілаз властивості: м. м. 63 кДа, оптимум рН 5,5, максимальна активність у діапазоні температур 30–50 0С і температурна стабільність до 50 0С. Однак досліджувані форми амілаз були нестабільними у процесі виділення внаслідок присутності протеолітичних ферментів. Амілаза 3 (м. м. 50 кДа) помітно відрізнялась від вищезазначених форм ферменту. Вона виявляла активність у широкому діапазоні рН (5,5–8,5), два максимуми активності при 5,5 і 7,5 і температурі 60–80 0С, мала високу термостабільність (70 0С) і зберігала початкову активність упродовж 20 днів при температурі 22 0С за обох значень рН. Амілаза 3 була ме-талозалежним ферментом, її активність підвищували іони Ca2+ і Mg2+, інгібували — ЕДТА й деякі метали — Cu2+, Zn2+, Co2+. На відміну від амілаз морських бактерій, амілаза морського гриба A. Flavipes Виявляла стійкість до екстремально високих концентрацій солі (15% NaCl).
A. Niger 1119 під час глибинного вирощування продукував амілази з високою активністю (3,9 Од ·мл–1) при 50–55 0С і рН 4,0 і зберігав стабільність при 53 0С протягом 200 год. Для того щоб встановити, чи можна використовувати цей фермент у процесі очищення, різні детергенти досліджували
З використанням екстракту амілази A. Niger І встановили можливість їх застосування для очищення хірургічних і ендоскопічних інструментів [19].
Деякі дослідники [20] показали здатність Твін-80 і рамноліпіду стимулювати активність позаклітинної амілази PenicilliumSimplicissium.
Амілазу виявили також у різних представників бактерій, як патогенних (Vibrio Cholerae, B. Anthracis, Streptococcus, Staphy-Lococcus, Pneumococcus), так і непатогенних (B. Mesentericus, B. Subtilis, B. Macerans) видів. Промислове значення, безумовно, можуть мати і фактично мають лише непато-генні бактерії. На особливу увагу заслуговують термостабільні амілази, які здатні гідролізувати нативний крохмаль і витримувати високі концентрації солей, а також лужні амілази, оскільки більшість відомих грибних амілаз, що їх широко застосовують у промисловості, виявляють активність у кислому середовищі.
Амілолітичні ферменти термофільного штаму Bacillus Sp. 86 виявляли активність при температурі 30–95 0С (термооптимум 85–90 0С) і в інтервалі значень рН 5,0–10,5 з двома рН-оптимумами (6,0 і 8,5). Активність препарату при 60 0С залишалася без змін протягом 4 год, а час його напівак-тивації при цій температурі — 9 год, при 90 0С активність препарату не змінювалась упродовж 50 хв, а час напівактивації становив 2 год [21]. Здатність досліджуваного ферменту здійснювати гідроліз крохмалю в умовах слабокислого, нейтрального і лужного середовищ є істотною перевагою перед іншими α-амілазами і зумовлює можливість використання його як каталізатора різних промислових реакцій розрідження крохма-левмісної сировини. Іони кальцію, які не впливають на активність α-амілази, значно підвищують стабільність ферменту, до того ж потреба в іонах цього металу зростає з підвищенням температури інкубації. Крохмалю, як специфічному субстрату α-амілази, також притаманний високий стабілізуваль-ний ефект. У 22,5%-му розчині крохмалю α-амілаза Bacillus Sp. 86 За відсутності іонів кальцію цілком стабільна протягом 100 хв при 90 0С і 80 хв при 100 0С. Встановлено, що даний фермент є глікопротеїном. Білкова глобула ферменту тісно зв’язана з вуглеводним компонентом, який становить до 16% сухої маси. Молекулярна маса α-амілази дорівнює 83–90 кДa. Молекула α-амілази Bacillus SР. 86, що містить 16 амінокислот і налічує в середньому 254 амінокислотних залишки, відзначається високим вмістом аспарагінової і глутамінової кислот, аланіну, валіну і триптофану. У молекулі ферменту не виявлено цистеїну. Припускають, що роль дисульфідних зв’язків у створенні структури термостабільної α-амілази відіграють іони кальцію [15].
Високотермостабільну амілазу, яка продукується Bacillus Sp. PN5, було ізольовано з ґрунту [22]. У разі вирощування на середовищі, яке містить (%) крохмаль (0,6), пептон (0,5) і дріжджовий екстракт (0,3), при 60 0С, рН 7,0, упродовж 60 год активність амілази, яка продукувалась, становила 65,23 Од/мл. Максимуму активності було досягнено при рН 10,0 і температурі 90 0С. Активність ферменту пригнічувалась при 105 0С на 65%, а при температурі від 80 до 100 0С була стабільною протягом 1 год. Фермент зберігав 83% активності після 1 год інкубації з доде-цилсульфатом натрію. Ці властивості вказують на можливість використання даної амілази при цукрофікації крохмалю і утворенні детергенту.
У Росії на цей час у промисловому масштабі виробляють препарати α-амілази на основі двох продуцентів — B. Subtilis (аміло-субтилін) і A. Oryzae (амілоризин) [23]. Однак ці амілази не належать до термостабільних ферментів, оскільки оптимальна температура їхньої дії 55–65 0С. Автори [23] методами мутагенезу і селекції одержали високопродуктивний штам B. Licheniformis 103, який здатен синтезувати термостабільну α-амілазу (температурний оптимум 90–95 0С, рН-оптимум 6,0–8,5). Оптимізацією складу ферментаційного середовища і умов глибинного культивування продуцента їм вдалося майже у 8 разів у порівняно з вихідним штамом підвищити активність амілази, яка становила 260 Од ·мл–1.
За допомогою іонообмінної хроматографії і гель-фільтрації очистили позаклітинну α-амілазу B. Subtilis [24]. Молекулярна маса її дорівнювала 48 кДа. Різноманітні іони металів навіть за низьких концентрацій інгібували активність α-амілази. Ca2+, Ba2+, Mn2+ і Ni2+ були слабкими, а Zn2+, Fe2+, Pb2+, Hg2+, Mg2+, Cd2+ і Cu2+ — сильними інгібіторами. Високі концентрації Ca2+ сприяли зниженню ферментативної активності, а за концентрації 2,5 мМ активність підвищувалась. ЕДТА також впливав на активність, аналогічно до впливу Ca2+ за низьких концентрацій. Відзначено підвищення активності ферменту в разі використання іонів металів у концентрації 10 мМ. Показники Km і Vmax для α-амілази становили 2,2•10–4 г•мл–1 і 0,020 Од•мл–1, 2,91•10–4 г•мл–1 і 0,016 Од•мл–1; 4,04•10–4 г•мл–1 і 0,021 Од•мл–1 у випадку
Використання як субстратів крохмалю, амілози і глікогену, відповідно.
Автори [25] ізолювали штами B. Subtilis JS-2004 з максимальною активністю 72 Од•мл–1 під час вирощування на рідкому середовищі з картопляним крохмалем упродовж 48 год при рН 7,0 і 50 0С. Додавання іонів Са2+ і дріжджового екстракту підвищувало продукування ферменту, тимчасом як додавання 1% глюкози сприяло значному інгібуванню. Оптимальної активності було досягнено при рН 8,0 і 70 0С. Фермент був стабільним протягом 1 год при 60 і 70 0С, водночас при 80 і 90 0С вихідна активність втрачалась на 12 і 48%, відповідно. Фермент активували іони Са2+ (117%), значною мірою інгібували іони Со2+, Сu2+ та Hg2+ і меншою мірою Mg2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+ і Mn2+. Штам продукував високі рівні α-амілази, яку можна використовувати в крохмале-пато-ковій та харчовій промисловості.
Зі зразків південноамериканських ґрунтів виділено штам B. Licheniformis MIR-61, який продукував підвищену кількість кислої α-амілази. У періодичних культурах B. Licheniformis MIR-61 У фазі експоненцій-ного росту виявляли позаклітинні α-амілази та глюкозидази. Максимальної активності α-амілази було досягнено при 45 0С і рН 7,0 у пізній експоненційній фазі. Оптимум активності цього ферменту спостерігався при 50–67 0С і рН від 5,5 до 6,0. α-Амілаза характеризувалася термостабільністю при 60 0С [26].
α-Амілаза B. Licheniformis Є високостабіль-ним ферментом, який широко використовують у біотехнологічних процесах. Незважаючи на те, що її продукує не термофільна бактерія, вона зберігає активність протягом декількох годин при температурі, вищій за 90 0С, в умовах промислового гідролізу крохмалю. Вона також більш стабільна, ніж α-амілаза B.Stearothermophilus і B. Amyloliq-Uefaciens, Попри значну подібність послідовностей між цими трьома білками. α-Амілаза B.Licheniformis є Цікавою моделлю для білкової інженерії під час дослідження термостабільності й термостабілізації. Автори [27] здійснили мутаційний і структурний аналіз α-амілази B. Licheniformis, Для того щоб з’ясувати походження незвичайних термальних властивостей і, якщо можливо, підвищити термостабільність ферменту. Ще до того як було встановлено тривимірну структуру, дослідники використали мутагенез та ідентифікували два критичних положення, в яких заміщення амінокислот може або підвищити, або знизити значною мірою необоротну термоінактивацію. Коли детальну Х-променеву структуру α-амілази B. Li-Cheniformis Було встановлено, заснований на структурі мутагенез застосували для визначення ролі залишків, які залучаються до утворення сольових містків, зв’язування з кальцієм або потенціальних процесів де-амідування. Результати дослідників [27] свідчать про ключову роль домена В та його взаємодії з доменом А у термостабільності α-амілази B. Licheniformis. Більшість мутацій, які автори вводили в цю ділянку, так чи інакше модифікували стабільність завдяки впливу на електростатичну взаємодію тріади металів Ca–Na–Ca у місці контакту доменів А/В. Мутаційні дослідження показали важливість тріади металів для підтримання правильного вигину домену А, а також розщеплення конформації активного центру. Однак подібний тріадний металзв’язуваль-ний центр також присутній у менш термостабільних бактеріальних гомологів, таких як B. Stearothermophilus І B. Amyloliquefaciens. Тому підвищена термостабільність α-амілази B. Licheniformis Не може бути зумовлена присутністю цієї тріади металів. У процесі мутаційних досліджень автори сконструювали понад 500 варіантів амілази, що несли від однієї до численних мутацій, серед яких було багато як високошкідливих, так і певною мірою корисних для стабільності. Кумулятивний ефект мутацій дав дослідникам можливість модулювати стабільність ферменту в діапазоні 50 0С, включаючи значне втручання в амілолітичну функцію. Незважаючи на те, що повного розуміння походження природної термостабільності α-амілази B.Licheniformis Ще не досягнено, дослідження авторів показали, що вона не є оптимальною і що є можливість підвищувати або знижувати її штучно декількома шляхами, використовуючи як випадковий, так і цілеспрямований мутагенез. Цікаво, що інженерно створені гіпертермостабільні варіанти α-амілази B. Licheniformis Є також більш стабільними за низьких значень рН.
Вивчаючи взаємодію α-амілази B. Amy-Loliquefaciens З дивалентними катіонами кальцію і кобальту, дослідники [28], встановили 17 сайтів зв’язування кальцію на ферменті зі слабкою позитивною кооперативніс-тю. Зв’язування як кальцію, так і кобальту є екзотермічним процесом. Кальцій стабілізував фермент проти сурфактантів і термальної денатурації. Більш того, зв’язування з кальцієм запобігало спонтанному
Зменшенню біологічної активності α-амілази. На ферменті існує 25 некооперативних сайтів для зв’язування іонів кобальту. Активність ферменту значно підвищується зі збільшенням концентрації кобальту, але температура денатурації ферменту знижується. Таким чином, дивалентні катіони кальцію і кобальту діють як стабілізатор і активатор, відповідно, для α-амілази B. Amyloliquefaciens.
Дослідники показали [29] здатність продукувати високоактивну амілазу для штамів Streptomyces Somaliensis GS 1242 і Strep-Tomyces Sampsonii GS 1322.
Зростаючи на середовищі з глюкозою, Clostridium Acetobutyricum Продукує позаклітинну α-амілазу. Фермент достатньо охарактеризований біохімічно, однак його ген поки що не ідентифіковано. Ген AmyP Кодує 80 013-Дa зрілий білок з N-кінцевим доменом, який є ідентичним такому родини 13 глікозилгідролаз, таких як α-амілаза Bacillus. Транскрипційний аналіз показав, що AmyP Транскрибується в розчині хемо-статної культури. Наведені дані відповідають активності α-амілази, а це свідчить про те, що експресія АmyP Регулюється на транскрипційному рівні. AmyР Локалізували на ме-гаплазміді pSOL1, яка несе всі гени, що беруть участь у кінцевій стадії утворення розчину. Дегенерація C. Acetobutyricum Пов’язана зі втратою pSOL1. Показано, що AmyP Можна використати як рецепторну систему для характеристики цього явища [30].
Новий термофільний спороутворюваль-ний штам MR3Ct, що його ізольовано з геотермального ґрунту, локалізованого на горі Ріттманн в Антарктиці, був здатен продукувати позаклітинну амілазу. На основі 16 S рРНК-послідовності було показано, що штам близький до Anoxybacillus Amylolyticus [31].
З Geobacillus Thermodenitrificans HRO10 [32] виділено й очищено до гомогенного стану (13,6 раза, 11,5% вихід) α-амілазу. Молекулярна маса, визначена за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу, становила 58 кДа. Активність була оптимальною на картопляному крохмалі при рН 5,5 і 80 0С. У присутності іонів Са2+ залишкова активність досягала 92% після 1 год інкубації при 70 0С. α-Амілаза не втрачала активності у присутності фітату (селективний інгібітор α-амілази) у концентрації 10 мМ і зберігала 90% максимальної активності після 1 год інкубації при 70 0С. ЕГТА і ЕДТА були сильними інгібіторами ферменту. α-Амілаза гідролізу-вала розчинний крохмаль при 80 0С з Km 3,05 мг·мл–1 і Vmax 7,35 Од·мл–1. Здатність до продукування позаклітинної α-амілази було виявлено і в галофільної бактерії Halomonas Meridiana [33]. Найвища продукція α-амілази спостерігалась наприкінці логарифмічної фази під час зростання культури на середовищі з 5% солей чи крохмалю за відсутності глюкози. Фермент виявляв максимальну активність при рН 7,0, але був відносно стійким і в лужних умовах. Оптимальні значення температури і солоності для активності α-амілази становлять відповідно 37 0С і 10% NaCl.
У біотехнологічних процесах, а саме у ферментативному гідролізі крохмалю у процесі одержання глюкози, використовують амілолітичні ферменти, які синтезуються термофільними археями [34].
Здатність до синтезу термостабільної α-амілази виявлена у Thermomyces Lanuginosus F1. Молекулярна маса й ізоелектрична точка для цього ферменту становили відповідно 55 кДа і 4,0. Максимальну стабільність α-амілаза виявляла при рН 4,0 і зберігала > 80% активності за рН 5,0–6,0 протягом 24 год. Після інкубації при 90 0С упродовж 1 год α-амілаза зберігала лише 6% активності. Активність ферменту зростала у присутності Mn+2, Co+2, Cu+2, Zn+2 і Fe+2, але інгібувалася гуанідин-НСІ, сечовиною і ЕДТА. Цей фермент має такі параметри рН і термостабільності, які роблять його перспективним для промислового використання [35].
Таким чином, представники різних таксономічних груп мікроорганізмів здатні продукувати активні α-амілази, з різноманітними фізико-хімічними властивостями, що визначає практичне використання їх у різних сферах життєдіяльності людей.