Экспериментальные исследования нашего университета

Внашем университетебыли проведены различные исследования синюхи голубой. Рассмотрим некоторые из них.

Разработана методика количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи с использованием спектрофотометрического метода. Для ее выполнения не требуется стандартных образцов. Относительная ошибка среднего результата не превышает 4,88 %. Методика может быть рекомендована для анализа сырья и лекарственных средств синюхи.

Постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья и препаратов из него вызывают необходимость количественной оценки содержания действующих веществ. Основными действующими веществами синюхи являются тритерпеновые сапонины (ТС). С помощью метода ТСХ и ВЭЖХ в корневищах с корнями синюхи обнаружено 11 ТС, из которых в индивидуальном состоянии выделено 3: полемониумсапонин 1, полемониумсапонин 2, полемониумсапонин 3.

Целью данной работы явилось количественное определение суммы ТС в корневищах с корнями синюхи.

Экспериментальная часть

Объектами исследования служили 5 серий корневищ с корнями синюхи:

Серия 1: п. Улановичи, Витебская область, сбор 2002 г.;

Серия 2: п. Улановичи, Витебская область, сбор 2003 г.;

Серия 3: п. Улановичи, Витебская область, сбор 2004 г.;

Серия 4: Центральный ботанический сад НАН Беларуси, г. Минск, сбор 2003 г.

Серия 5: Центральный ботанический сад НАН Беларуси,г. Минск, сбор 2004 г.

Приборы и материалы

Спектры поглощения и величины оптической плотности измеряли на спектрофотометре СФ-46. ТСХ выполняли на пластинках Sorbfil, 10 х 10 см с использованием подвижной фазы н -бутанол — кислота уксусная — вода (5:1:4) верхний слой. В качестве проявителя для хроматографических пластин использовали 10% раствор фосфорно-молибденовой кислоты в спирте этиловом 96% с последующей обработкой пластин парами аммиака. Твердофазную экстракцию осуществляли с использованием сорбента Диа-сорб-100-С16 с диаметром частиц сорбента 63 - 200 мкм (ЗАО "БиоХимМак СТ").

В качестве стандарта при разработке методики использовали спиртовой раствор рабочего стандартного образца (РСО) B-эсцина.

Подготовка хроматографической колонки. Вносили 0,2 г сорбента Диасорб-100-С16 в полипропиленовый патрон марки Диапак с внутренним диаметром 10 мм, в нижнюю часть которого помещали стекловату. Добавляли 0,3 мл спирта этилового 96 %. Оставляли на 15 мин, промывали 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Скорость регулировали при помощи вакуумной системы.

Подготовка раствора сравнения. Подготовленную хроматографическую колонку промывали под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывали и колонку промывали 1 мл спирта этилового 96 % в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривали, добавляли 10 мл кислоты серной концентрированной. Термостатировали при температуре 70 °С в течение 60 мин, после чего раствор охлаждали.

Построение калибровочного графика продуктов реакции B-эсцина с кислотой серной концентрированной. Растворяли 0,0500 г (точная навеска) РСО B-эсцина в спирте этиловом 70 % в мерной колбе вместимостью 50 мл и доводили объем раствора в колбе до метки (раствор А).Помещали 0,5, 1, 1,5, 2, 3,4, 5, 7, 8 мл раствора А в колбу вместимостью 100 мл и доводили объем растворов в колбах водой до метки. По 2 мл полученных разведений наносили на подготовленную хроматографическую колонку. Промывали под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывали. Сумму ТС элюировали 2 раза по 0,5 мл спирта этилового 96 % в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривали досуха, к остатку добавляли 10 мл кислоты серной концентрированной. Термостатировали при 70 °С в течение 60 мин и после охлаждения измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 321 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Выбор оптимальных условийэкстракции ТС из сырья синюхи. Для выбора оптимальных условий экстракции было проведено исследование по определению влияния на полноту извлечения суммы ТС из сырья синюхи следующих факторов: 1 — природы экстрагента (вода очищенная, спирт этиловый 20 %, спирт этиловый 40 %, спирт этиловый 70 %, спирт этиловый 96 %), 2 — степени измельчения (0,5 - 1,0 мм, 1,012,0 мм, 2,0 - 3,0 мм, 3,0 - 5,0 мм), 3 — соотношения сырье — экстрагент (1:100, 1:50, 1:30, 1:15), 4 — числа экстракций (1,2,3,4 раза).

Методика количественногоопределения суммы ТС в сырье синюхи. Помещали 1,0 г (точная навеска) измельченных корневищ с корнями синюхи, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл хлороформа. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее хлороформное извлечение процеживали через вату. Вату помещали в колбу для экстрагирования, прибавляли 50 мл хлороформа и по-вторяли экстрагирование на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Вытяжку процеживали через вату. Хлороформное извлечение отбрасывали. Вату поме-щали в колбу для экстрагирования, прибавляли 50 мл спирта этилового 40% и экстрагировали в течение 30 мин. Извлечение процеживали через вату в мерную колбу на 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещали в колбу для экстрагирования, прибавляли 50 мл спирта этилового 40 % и экстракцию повторяли еще раз в описанных выше условиях, процеживая извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводили спиртом этиловым 40 % до метки и перемешивали (раствор А).

Переносили 1 мл раствора А в мерную колбу на 25 мл и доводили водой очищенной до метки (раствор Б).

Наносили 2 мл раствора Б на подготовленную хроматографическую колонку. Промывали под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывали. Сумму тритерпеновых сапонинов элюировали 2 раза по 0,5 мл спирта этилового 96 % в пробирку, снабженную притертой пробкой, вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривали досуха, к остатку добавляли 10 мл кислоты серной концентрированной. Термостатировали при 70 °С в течение 60 мин и после охлаждения измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 321 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Контрольный опыт проводили следующим образом: подготовленную колонку с сорбентом Диа-сорб-100-С16 промывали под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывали и колонку, промывали 1 мл спирта этилового 96 % в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривали досуха, к остатку добавляли 10 мл кислоты серной концентрированной. Термостатировали при 70 °С в течение 60 мин и охлаждали.

Содержание суммы ТС в пересчете на B-эсцин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляли по специальной формуле.

Результаты исследования

Известны способы количественного определения ТС: ВЭЖХ, ВЭТСХ с использованием сканирующей денситометрии, гравиметрическое определение, потенциометрическое титрование, после предварительного разрушения гликозидной связи ТС, спектре фотометрическое определение. Применение ВЭЖХ и ВЭТСХ требует специально го оборудования и стандартных образцов. Стандартные образцы индивидуальных ТС являются дорогими и не всегда доступными. Методики, основанные на разрушении молекул сапонинов, достаточно длительны, а гравиметрический метод может давать неоднозначные результаты.

При анализе индивидуальных веществ группы ТС наиболее часто применяется спектрофотометрический метод, основанный на химической реакции агликонной части гликозидов с кислотой серной концентрированной. Терпеноиды, содержащие олефиновую двойную связь, при взаимодействии с серной кислотой образуют карбкатион с характерным максимумом поглощения при 310 нм. Широкому внедрению данного метода для анализа ТС в растительном сырье мешают сопутствующие соединения. Для очистки от неполярных балластных веществ применяли предварительную экстракцию хлороформом, от полярных — твердофазную экстракцию с использованием сорбента Диасорб-100-С16. Контроль за работой хроматографической колонки осуществляли методом ТСХ. Установлено, что при промывании колонки водой в водном элюате не содержится B-эсцина в случае построения калибровочного графика и ТС при количественном определении суммы ТС в сырье синюхи. При однократном элюировании 0,5 мл спирта этилового 96 % B-эсцин и ТС смывались с колонки неполностью. При двукратном элюировании по 0,5 мл спиртом этиловым 96 % и B-эсцин и ТС полностью смывались с колонки.

Калибровочная зависимость оптической плотности пределах концентраций раствора РСО B-эсцина в пределах концентраций 0,000116 - 0,001856 % подчиняется закону Бугера - Ламберта - Бера. Значение удельного показателя поглощения продуктов взаимодействия B-эсцина с кислотой серной концентрированной составляет 422.

Степень десорбции раствора РСО B-эсцина составляет 91%.

Анализ полученных данных свидетельствует, что наибольшая эффективность экстракции наблюдается при использовании спирта этилового 40 %. С увеличением размера частиц выход ТС уменьшается незначительно. В качестве оптимальной выбрана степень измельчения сырья до 2,0 мм. При изучении соотношения сырья и экстрагента установлено, что наименьший выход суммы ТС наблюдался при соотношении 1:15. Соотношение сырье и экстрагент 1:30, 1:50, 1:100 позволяет извлечь максимальное количество ТС. Нами выбрано соотношение сырья и экстрагента 1:50. При изучении влияния числа экстракции на выход ТС из сырья синюхи установлено, что при двукратной экстракции извлекалось 92,9 % ТС, третья и четвертая экстракции оказались менее эффективными, так как после их извлекалось 4,9 и 2,2 % определяемой группы веществ соответственно. Поэтому было предложено использовать двукратную экстракцию.

Методика количественного определения суммы ТС была апробирована на 5 сериях сырья синюхи.

Отсутствие систематической ошибки разработанной методики было доказано методом добавок PCО B-эсцина к испытуемому раствору на стадии нанесения на колонку. Из результатов следует, что методика не осложнена систематической ошибкой, поскольку в опытах с добавками во всех случаях ошибка определения не превышала относительной ошибки единичного определения.

Таким образом, разработанная методика может быть рекомендована для стандартизации сырья синюхи и лекарственных средств на ее основе [10].

Далее была разработана методика идентификации тритерпеновыхсапонинов в корневищахс корнями синюхиметодом тонкослойнойхроматографии. Оптимальные условия проведения ТСХ: силикагельная пластина - «Сорбфил», раствор сравнения - раствор эсцина, элюирующая система - бутанол Р — этанол 96% Р - аммиака раствор концентрированный Р (10:4:4), детектирующий реагент - раствор фосфорномолибденовой кислоты Р.

Выводы:

1. Разработана методика идентификации тритерпеновых сапонинов корневищ с корнями синюхи.

2. Подобраны оптимальные параметры проведения ТСХ-анализа для тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи.

3. Разработанная методика может быть использована для стандартизация корневищ с корнями синюхи голубой и лекарственных средств на ее основе [11].

Проведено определение потерь на диффузию при получении жидкого экстракта корневищ с корнями синюхи. Показано, что потери на диффузию уменьшаются с увеличением объема экстрагента.

Выводы

Таким образом, с точки зрения содержания БАВ оптимальным можно считать жидкий экстракт корневищ с корнями синюхи 1:2.

Уменьшить потери на диффузию можно используя отжим шрота на прессах, применяя дробное экстрагирование и увеличивая объем экстрагента.

На основе разработанного жидкого экстракта корневищ с корнями синюхи получен ее сухой экстракт, который не содержит спирта этилового [12].