Применение архей в биотехнологии

В настоящее время некоторые метаболиты архейного происхож­дения нашли применение или рекомендованы для практического использования. Внеклеточные полисахариды галофилов облегчают добычу нефти, а выделяемые клетками галоархейные полимеры (полиалканоаты) рассматривают как сырье для производства биодеградабельных пластиков и материала для хирургии. Метаногены в ряде стран используют для получения биогаза из возобновляемых­ субстратов с одновременным удалением бытовых, городских и сельскохозяйственных отходов. Ацидофильные археи, способные к окислению сульфидных минера­лов, играют важную роль в геохимическом цикле серы и рекомендованы для использования в биометаллургии для выщелачивании бедных руд при добыче ценных металлов. Sulfolobus.acidocaldarius предлагают использовать для десульфуризации каменных углей, содержащих FeS₂, и удаления из углей серосодержащих (тио­феновых) соединений. Гликопротеиновые S-слои и бактериородопсин галофилов, способ­ные к самосборке, интересны для нанотехнологических процессов. Липосомы, образованные из исключительно стабильных липидов архей, позволили создать новую систему иммунных адьювантов. Невосстанавливающий дисахарид трегалоза широко используется в различных областях промышленности. Получают его из дрожжей. Как источник продукта для промышленного синтеза трегалозы интерес представляет S.shibata. Преимущество ферментов экстремофилов состоит в их высокой стабильности и пониженном риске заражения. Они могут заполнить пропасть между биологическими и химическими процессами. По сравне­нию с катализаторами ферменты часто имеют большую специфичность, которая позволяет получать определенные стереоизомеры, биокатализ протекает с более низким числом побочных реакций и меньшим загряз­нением окружающей среды.

Уже идентифицировано более 3 тыс. различных ферментов, и некото­рые из них нашли применение в биотехнологии и промышленности:

	Ферменты	Применение
	Термофилы Протеазы Гликозилгидролазы (амилазы, пуллуланазы, глюкоамилазы,	Детергенты, гидролиз при приготовле­нии пищи и кормов, пивоварение Процессинг крахмала, целлюлозы, пек­тина, текстильная промышленность
	глюкозидазы, целлюлазы, ксиланазы) Хитиназы Ксиланазы Эстеразы, липазы ДНК-полимераза Дегидрогеназы ДНК-лигаза	Модификация хитина для пищевых и лекарственных продуктов Отбеливание бумаги Стереоспецифические реакции, органи­ческие биосинтезы, детергенты Молекулярная биология (ПЦР) Окислительные реакции Молекулярная биология
	Психрофилы Протеазы Амилазы Целлюлазы Дегидрогеназы Липазы	Детергенты, использование в пище, (например, в молочных продуктах) Детергенты и хлебопечение Детергенты, корма, текстильная про­мышленность Биосенсоры Детергенты, пища, косметика
	Галофилы Протеазы Дегидрогеназы Алкалофилы	Синтез пептидов Биокатализ в органических средах
	Протеазы, целлюлазы Ацидофилы	Детергенты, пища, корма
	Амилазы, глюкоамилазы протеазы, целлюлазы Пьезофилы	Процессинг крахмала, компоненты кормов
	Точно неизвестно	Процессинг пищи, продукция анти­биотиков

 

 

Но многие доступные ферменты не выдерживают условий проведе­ния реакций в промышленных масштабах. Поэтому интерес представля­ют микроорганизмы, живущие в экстремальных условиях, как источни­ки новых экстремофильных ферментов или экстремозимов.

ПРОЦЕССИНГ МИНЕРАЛОВ

В ряде стран (Австралии, Бразилии, Южной Африке, Ганне) в последние десятилетия налажен процессинг минералов в биореакторах с использованием железо и сероокисляющих бактерий. Процессинг предусматривает выделение золота из сульфидных руд (арсенопирита, FeAsS₂, пирита, FeS₂, пиррхотита, Fe₇S₈) биоокислением с последующей очисткой золота методом цианидирования. На самых больших заводах обрабатывает­ся около 1000 т в день тугоплавких концентратов золота с использованием смешанной культуры мезофильных или, в некоторых случаях, термофиль­ных бактерий при температуре 40 °С. Ацидофильные бактерии задействова­ны в промышленности биовыщелачивания менее дорогих металлов: меди и никеля. Археи представляют интерес для выделения меди из халькопирита (CuFeS₂), который среди других минералов отличается наибольшей устойчи­востью к растворению. Окисление Fe⁺² — ключевая реакция при растворе­нии промышленных минеральных сульфидов ацидофилами, которая у термофильных­ архей происходит с более высокими скоростью и эффективностью­, так как при повышенной температуре диффузия ионов усиливается.

В процессе выщелачивания температура повышается вплоть до 80 °С, но при использовании гипертермофильных архей охлаждения не требу­ется, что делает процесс энергосберегающим.

Среди архей окисление минералов осуществляют Ferroplasma aci­dophilus, Sulfolobus metallicus (оптимальная активность при 70 °С), Metallosphaera sedula, Acidianus brierley, но наиболее быстрое окисление пирита и наиболее эффективную экстракцию меди из халькопирита при 80—85 °С выполняет охарактеризованная смешанная культура Sulfolobus-подобных организмов. S. acidocaldaricus предлагают использо­вать в биометаллургии для выделения золота и других редких металлов из сульфидных руд. Преимущество этого археона перед ацидофильными тионовыми бактериями состоит в следующем: выделение металлов из минеральных сульфидов лучше происходит при повышенной темпера­туре — 60 °С; не требуется охлаждения реактора, что позволяет сберегать энергию; S.acidocaldaricus отличает высокая устойчивость к металличе­ским ионам: археон устойчив при содержании 25—30 г/л ионов меди (при окислении халькопирита), в то время как устойчивость другого археона — Metallosphaera sp., ограничена 5 г/л меди; увеличенный выход продукта и степень деградации некоторых минеральных сульфидов.

ДЕСУЛЬФУРИЗАЦИЯ ВЫХЛОПНЫХ ГАЗОВ

На мощных заводах или химических предприятиях в ряде техни­ческих процессов непосредственно задействованы культуры живых гипертермофилов­. В частности, гипертермофильные автотрофные сульфитредукторы используют для десульфуризации выхлопных газов. В этом процессе S0₂ вначале вымывается из газовой смеси, затем восстанавливается­ до H₂S в анаэробном реакторе гипертермофилом, например Archaeglobus veneflcus, в присутствии Н₂ или метанола как доноров элект­ронов. Во втором аэробном реакторе H₂S окисляется и получают высоко очищенный ценный конечный продукт — элементарную серу, в то время как при стандартном процессе десульфурикации газов образуется гипс, который вследствие содержания тяжелых металлов является отходом производства.

ПОЛУЧЕНИЕ БИОГАЗА ИЗ ВОЗОБНОВЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ

В процессе метаногенеза на Землю возвращается почти 80% энергии заключавшейся в окисленном субстрате, а остаток после метаногенеза служит хорошим калийным, азотным и фосфорным удоб­рением. Продукт, получаемый на основе метанового брожения, имеет еще одно преимущество: он не содержит болезнетворных микроорганиз­мов, поскольку они погибают в процессе метаногенеза. Только переработ­ка отходов сельского хозяйства может дать такое количество метана, кото­рого достаточно для получения 10% всей потребляемой на Земле энергии.

В Китае работают более одного миллиона биогазовых установок, в Индии — более 100 тыс. гобар-заводов («гобар» на языке хинди означает навоз) и в ближайшие годы там собираются ввести в действие еще 500 тыс. таких установок. Это не удивительно, если учесть, что в Индии живет 20% мирового поголовья коров и буйволов. Процесс образования метана из отходов животноводства происходит значительно интенсивнее при внесении предварительно адаптированной закваски, представляю­щей собой термофильную ассоциацию метаносарцин — Methanosarcina mazei и Methanosaeta thermophila, и дополнительного количества ацетата. Температурный оптимум термофильной ассоциации — 52 °С.

При превращении ацетата в метан выделяется только 32 кДж/моль СН₄, поэтому клетки для получения необходимой энергии деградируют ацетат в больших количествах. Это — стратегия природы для удаления огромных запасов ацетата, который образуется при анаэробном разложе­нии органических веществ. Существенно, что СН₄ может образовывать­ся в условиях, субоптимальных для роста, это значит, что метаногенез может быть и не сопряжен с ростом культуры.

В МГУ на кафедре химической энзимологии разработан экономиче­ский способ получения метана из биомассы с увеличенной в 50—100 раз производительностью благодаря использованию биокатализаторов. Предполагается, что через 5—7 лет внедрение новой технологии позволит получать половину топлива, необходимого для городского транспорта.

ТЕРМОАРХЕЙНЫЕ ЭКСТРЕМОЗИМЫ

Одна из важнейших проблем, связанных с применением фер­ментов, — это их нестабильность, и использование архейных ферментов позволяет эту проблему решить. Гипертермофилы привлекают большое внимание как источники ферментов, поскольку обитают при высокой температуре и их ферменты функционируют при тех же температурах, проявляя при этом высокую термостабильность, устойчивость к дейст­вию детергентов, окислителей, протеаз.

Молекулярные свойства экстремозимов, обусловливающие их устойчивость к экстремально высоким температурам, закодированы генетиче­ски: в белках увеличено число солевых мостиков, водородных связей, усилены гидрофобные взаимодействия, повышена гидрофобность бел­кового кора, имеются дополнительное спаривание ионов и замещения выступающих термолабильных аминокислот. Это увеличивает термаль­ную стабильность, ригидность и устойчивость ферментов к химической денатурации. Экстремозимы получают из экстремальных или гипертермофильных организмов. Слож­ность культивирования гипертермофилов связана с тем, что их метабо­лизм основан на восстановлении элементарной серы до сероводорода. Поэтому используются специальное оборудование и условия для выра­щивания.

Больше всего изучались экстремозимы из рр. Pyrococcus и Thermococcus, которые могут расти в отсутствие серы.

Алкогольдегидрогеназы

Ферменты кальдерных архей представляют интерес для органи­ческой химии. Хиральные спирты, применяемые в фармацевтике, полу­чают при восстановлении соответствующих кетонов и альдегидов, используя для этого ферменты, выделенные из бактериального штамма Thermoanaerobacter sp. Алкогольдегидрогеназы подвергаются денатура­ции, если концентрация растворителей (спирта, альдегида или кетона) превышает 10% при температуре выше 35 °С.

Ферменты, выделенные из Sulfolobus sp., отлично работают при более высоких температуре и концентрации растворителя. Некоторые реакции в органическом синтезе лучше протекают и направлены в сторону синтезируемого продукта в органическом растворителе при низком содержании воды. Это, например, касается эстеразных и трансэстеразных реакций.

Гликозилгидролазы

В промышленности особое значение имеют экстремофильные протеазы, липазы и ферменты, деградирующие полимеры такие, как целлюлазы, хитиназы и амилазы. Эти ферменты гидролизуют гликозидные связи между двумя или большим числом углеводов или между угле­водом и неуглеводным ядром. Их подразделяют на гликозилгидролазы, расщепляющие крахмал (а-1,4 и а-1,6-гликозидные связи), ксилан или целлюлозу — полимеры, содержащие (3-1,4-гликозидные связи.

Ферменты, расщепляющие крахмал

При расщеплении крахмала под действием а-амилазы образу­ются глюкоза и олигосахариды. Оптимальная температура для действия а-амилазы Rfuriosus и P.woesi — 100 °С. В отличие от мезофильных ами­лаз, а-амилаза указанных архей не требует присутствия Са. а-Амилаза из P.furiosus клонирована, секвенирована и экспрессирована в E.coli и Bacillus subtilis. Thermococcus profundus образует S- и L-амилазы. Опти­мальная температура для первого фермента — 80 °С. Для его стабилиза­ции при повышенной температуре требуется Са⁺². Амилаза L проявляет высокую активность в кислых условиях. а-Амилазы из архей порядка Thermoproteales, Thermococcales и Ryrodictiales термостабильны в отсутствие Са⁺² или субстрата. Ферменты гипертермофильных и термофильных архей, деградирующие крахмал.

Пуллуланазы

Пуллуланазы типа II гидролизуют а-1,4- и а-1,6-гликозидные связи в разветвленных участках полимеров. Пуллуланазы типа I расщеп­ляют а-1,6-гликозидные связи и у архей встречаются редко. Пуллуланаза типа II у P.woesi и R.furiosus наиболее термоактивны среди других опи­санных ферментов. Очищенный рекомбинантный белок P.woesi наибо­лее эффективно работает при 100 °С, pH 6 и его активность увеличивает­ся при добавлении кальция или восстановленных агентов.

а-Глюкозидазы

Фермент включается на конечной стадии деградации гликогена, отщепляя терминальные остатки глюкозы. а-Глюкозидаза, выделенная из S.solfataricus, очищена. Температурный оптимум для этого фермента — 105 °С, что на 20 °С выше оптимальной температуры роста штамма. Про­филь термальной активности и субстратной специфичности фермента указывает на отличие от соответствующего аналога у P.furiosus. Из Thermococcus sp. выделена и очищена внеклеточная а-глюкозидаза.

Ксилан-деградирующие ферменты

Ксиланы — гетерогенная группа полисахаридов; главная цепь молекулы которых состоит из Р-1,4-связанных)-ксилопиранозильных субъединиц. Термостабильные ксиланазы представляют интерес для процесса отбеливания бумаги, как альтернатива традиционной техники, применяющей для этой цели хлор. Деградацию непредобработанного ксилана осуществляют P.furiosus, Thermococcus sp. и Th.zilligii.

Ферменты, деградирующие целлюлозу

Целлюлоза — наиболее широко распространенный природный полимер на Земле. Ее молекула может содержать до 14 тыс. глюкозных остатков, связанных Р-1,4-связями. Целлюлазы распространены широко среди грибов и бактерий, но имеется лишь одно сообщение о наличии архейной целлюлазы (эндоглюконазы) у археона P.furiosus, хотя р-гликозидные ферменты содержат многие термофильные и гипертермофильные археи.

У P.furiosus, выращенного в среде с целлобиозой (продукта расщепле­ния целлюлозы), Р-глюкозидаза составляет до 5% всех белков клетки, Термостабильные р-глюкозидазы обнаружены также у различных штам­мов порядка Sulfolobales, хотя физиологическая роль фер­мента непонятна.

Протеиназы

Среди ферментов протеазы имеют самое большое коммерческое значение. Их производят на много больше, чем других ферментов. Из термофильных и гипертермофильных архей выделены различные проте­азы, главным образом серинового типа. Во многих случаях эти ферменты сохраняют каталитическую активность не только при вы­сокой температуре, но и в присутствии детергентов или других денатури­рующих агентов. У Desulfurococcus, штамм SU, обнаружена связанная с клеткой сериновая протеаза со временем полураспада 4,3 ч при 95 °С. Исключительно термоустойчивая сериновая протеаза из Staphylothermus marinus сохраняет каталитическую активность даже после 10 мин нагре­вания при 135 °С (Мауг, 1996). Протеазы субтилизинового типа обнару­жены у Pyrobaculum aerophilum (аэролизин) и P.furiosus (пирролизин). Пирролизин сохраняет активность после 20 мин нагревания при 105 °С. Р. furiosus содержит, по крайней мере, 13 различных белков с протеолити­ческой активностью, в том числе пролилэндопептидазу (новый тип про­теаз), которая клонирована и сверхэкспрессирована в E.coli. Из S.acido- caldaricus выделена, идентифицирована и клонирована кислая протеаза; в экстрактах клеток S.solfataricus обнаружена карбоксипептидазная ак­тивность. Для биотехнологического производства особый интерес пред­ставляет протеаза, выделенная из аэробного гипертермофила Aeropyrum pemix К1. На сегодня это наиболее термостабильная внеклеточная металлопротеаза с температурным оптимумом 90 °С и временем полураспа­да 12 мин при 110 °С. Штамм-продуцент растет при 90 °С со временем генерации 200 мин.

Ферменты для процессинга ДНК

Термофильные ДНК-полимеразы служат основой полимераз­ной цепной реакции при амплификации ДНК. Vent-полимераза Tc.litoralis, ДНК-полимераза из Thermococcus sp., штамм 9 совершают в 5—10 раз меньше ошибок, чем широко используемая Taq-полимераза Thermus aquatic us. Наибольший интерес представляет ДНК-полимераза Pyrococcus sp. штамм KOD1, которая при ничтожном количестве ошибок обладает высокими процессивностью и скоростью удлинения фрагмен­та. ДНК-полимераза Tc.litoralis — первый пример архейного интейна транслирующего белковую последовательность, но в конечном продукте не присутствующего. Способ очистки белков с использованием интейнов рекомендуют применять для биотехнологических целей.

Археи служат также источником ДНК-лигазы (см. выше). Фермент идентифицирован у Desulfurolobus (Acidianus) ambivalens. ДНК-лигаза из T.kodakaraensis KOD1 клонирована, секвенирована; получен очищенный рекомбинантный фермент, проявляющий лигазную активность в диапа­зоне температур от 30 до 100 °С. Фермент ATP-зависим (может функци­онировать и с NAD⁺ в качестве донора АМР) и катализирует лигирова­ние только «правильных» субстратов.

У Thermoplasma acidophilus обнаружена термостабильная пирофосфата­за, которая нашла применение при изучении ДНК-последовательностей.

Эстеразы

Эстеразы применяют в различных промышленных процессах, число которых выросло в связи с открытием термостабильных эстераз, для стереоспецифического гидролиза, трансэстерификации, синтеза эстеров и в других реакциях органического синтеза. Эстераза, выделен­ная из гипертермофильного археона, дает возможность осуществлять реакцию при высокой температуре, что позволяет увеличить раствори­мость субстрата и продукта и использовать более высокие концентрации растворителей эстеразы. Те же преимущества дает использование тран­сэстераз гипертермофилов с целью получения эфиров с новыми радика­лами. Очищенная эстераза SMcidocaldaricus термоустойчива в органиче­ских растворителях. Ген эстеразы P.furiosus, клонирован и экспрессиро­ван в E.coli; рекомбинантный белок является наиболее термостабильной и термоактивной эстеразой из известных. Период полураспада фермента составляет 50 мин при 126 °С.

Хитиназы

После целлюлозы хитин занимает второе место на Земле по сво­ему распространению. Т. chitinophagus — первый археон, у которого обна­ружены хитиназы и N-ацетилглюкозаминидазы, вовлекаемые в деграда­цию хитина.

ПСИХРОФИЛЫ И ПСИХРОФИЛЬНЫЕЭКСТРЕМОЗИМЫ

Места обитания организмов с высокой температурой не являют­ся широко распространенными на Земле, в противоположность посто­янно холодным местам.

Большая часть микроорганизмов, выделенных из холодных мест, от­носится к психротолерантным (их также называют психротрофными) и психрофильным. Первые хорошо растут при температуре, близкой к температуре замерзания воды, но самую высокую скорость роста имеют при температуре выше 20 °С, а психрофильные микроорганизмы быст­рее всего растут при 15 °С или ниже и не могут расти при температуре выше 20 °С Археи обитают во многих водоемах с низкими температурами. В планктоне Тихого океана, взятого с глубины 100 и 500 м, присутству­ют различные архейные штаммы. Археи составляют более 1/3 прокари­отной биомассы береговых антарктических вод, включая членов царства Crenarchaeota. Кренархеотный штамм Cenarchaeum symbiosum живет как симбионт в морской губке и растет при 10 °С. Из царства эвриархеот изо­лированы три штамма свободно живущих психрофильных архей: Methanococcus burtonii (минимальная температура - минус 2,5 °С, опти­мальная — 23 °С), Methanogenium frigidum (минимальная температура — минус 10 °С, оптимальная — 15 °С), первоначально выделенные со дна Ледяного озера Антарктиды, насыщенного метаном, и галофильный археон — Halorubrum lacusprofundi (минимальная температура — 2 °С, оптимальная — 33 °С), тоже выделенные в Антарктиде. Изучение фер­ментов этих видов только начинается. Показано, что Mc.burtonii при росте при низких температурах аккумулирует К-аспаргат, что приводит к снижению величины К_т для связывания GTP фактором элонгации 2 (EF-2). Холодоактивные гены архей экспрессированы в E.coli и получе­ны рекомбинантные продукты. Особенности ферментов психрофилов

В ферментах психрофилов содержатся специфические измене­ния в последовательностях аминокислот, меньшее число дисульфидных связей и солевых мостиков, в спиралевидных дипольных структурах — меньшее число зарядов, чем у термофилов, характерно увеличение взаи­модействий с растворителями, сниженное число водородных связей на интерфазах доменов и более низкая степень гидрофобных взаимодейст­вий в коровой части белка (Russell, 2000). Эти модификации делают белки более гибкими в структурном отношении и каталитически более активными на холоде. Приведенные адаптации носят противоположный характер по отношению к тем, которые придают термостабильность белкам экстремальных термофилов.

Ферменты психрофилов практически интересны в связи с возможно­стью снижения расхода энергии. С такими ферментами, как дополни­тельными детергентами, возможна работа прачечных с использованием холодной воды.

В этой сфере обслуживания особый интерес представляют психро- фильные протеазы, амилазы и липазы. Древесная масса (пульпа) и цел­люлозобумажная промышленность также заинтересованы в ферментах, деградирующих полимеры при низких температурах, как и некоторые типы процессингов пищи, например расщепление пектинов пектиназа- ми при процессинге фруктовых соков. Психрофильные метаногены мо­гут быть использованы для очистки сточных вод и продукции метана при низких температурах.

ГАЛОАРХЕЙНЫЕ ЭКСТРЕМОЗИМЫ

Две группы галофильных архей: аэробные галоархеи и анаэроб­ные галофильные метаноархеи используют различные способы сущест­вования в солевых окружениях. Цитоплазма метаногенов содержит низ­кую концентрацию соли благодаря высокой концентрации осмолитов, а биохимические процессы у галофилов функционируют при концентра­ции соли, близкой к насыщению. Они аккумулируют NaCl или КС1 до концентраций изотонических или превышающих концентрации этих солей в окружающей среде, и ферменты галофилов функционируют и адаптированы к очень высоким концентрациям соли вследствие приоб­ретения большого числа отрицательно заряженных аминокислотных ос­татков на поверхности белков, что предотвращает высаливание. В усло­виях с низкой концентрацией солей растворимость галофильных фер­ментов часто очень низкая, что создает определенные ограничения в их применении, но это свойство имеет преимущество при использовании этих ферментов в водно-органической и неводной средах. Например, внеклеточная протеаза Halobacterium halobium используется для активно­го синтеза пептидов в растворителе: вода / N'-N'-диметилформамид.

Галофильные археи представляют коммерческий интерес как источ­ники бетаинов или эктоина — стабилизирующих агентов, полимеров, используемых в производстве биодеградабельных пластиков, полисаха­ридов, солеустойчивых липидов (см. выше). Солеустойчивость бактери- ородопсина важна для его использования в галографических пленках и биоэлектронике. Ферменты галофилов длительное время сохраняют ста­бильность при температуре окружающей среды и часто проявляют зна­чительную термоустойчивость. Как ранее отмечалось, каталитическая активность галоферментов сохраняется при низкой активности воды, например в присутствии большого количества органических растворите­лей.

Из штаммов рода Halococcus выделен новый рестрикционный фер­мент с необычайно высокой специфичностью. Химотрипсиногенподоб- ная протеаза получена из галоалкалофильного археона Natronomonas pharaonis. В отличие от многих протеаз, теряющих активность при низ­кой концентрации соли, протеаза N.pharaonis может функционировать при довольно низкой концентрации — 3 ммоля, поэтому этот экстремо- зим наиболее интересен как дополнительный детергент. Недавно удалось использовать заключенную в обращенные мицеллы р-нитро-фе- нилфосфатазу из Halobacterium salinarium при очень низкой концентра­ции соли. В этих условиях фермент сохранял активность и стабильность. Такие же результаты получены с галофильной малатдегидрогеназой. Обращенные мицеллы в комбинации с галофильными ферментами открывают путь новым способам их практического применения.

ЭКСТРЕМОЗИМЫ АРХЕЙНЫХ ПЬЕЗОФИЛОВ

Пьезофильные (барофильные) микроорганизмы, включая тер­мофильные и гипертермофильные архейные штаммы, обитают при дав­лении в среднем 38 МПа в водах мировых океанов. Высокие давления необходимы в различных отраслях промышленности, например, для процессинга и стерилизации пищевых продуктов.

Использование ферментов пьезофилов — новая биотехнологическая альтернатива по отношению к традиционной. Высокое давление может

оказывать влияние на активность ферментов. Гидрогеназы, глицеральде- гид-3-фосфатазы и а-глюкозидазы, полученные из клеток Methanococcus jannaschii и Mc.igneus, первоначально выделенных из глубины соответст­венно 2600 и 100 м проявляли более высокую активность при повышен­ном давлении. ДНК-полимераза из P.furiosus и Pyrococcus sp. также были стабилизированы при высоком давлении и повышенной температуре.

Получение ферментов из экстремофилов

Идентификация потенциально полезных ферментов служит только первым шагом на пути получения ценных ферментов. У иденти­фицированного фермента должны быть необходимые биокаталэтиче­ские свойства и он должен соответствовать требованиям практики.

Существует две стратегии для получения ферментов из экстремофи­лов: увеличение выхода биокатализатора оптимизацией условий для на­копления биомассы продуцента; клонирование гена, кодирующего био­катализатор, и экспрессия его в подходящем хозяине.

Биокатализатор непосредственно из экстремофила часто получают на специальном оборудовании. Выход биомассы можно увеличить либо оптимизацией состава среды, либо варьированием специальных фер­ментационных процедур. Часто используют специальные биореакторы такие, как эйрлифтные ферментеры. Например, для получения полиглу- таминой кислоты при культивировании экстремальных галофиловдолж­ны быть разработаны специальные биореакторы, устойчивые к биокор­розии. Другое специальное требование к оборудованию может быть свя­зано с необходимостью создания высоких давлений, требуемых для куль­тивирования микроорганизмов, выделенных из морских глубин.

Биокатализатор может быть получен в условиях, не требующих специ­альной технологии для культивирования экстремофилов, если гены фер­мента клонировать в мезофильных хозяевах. Большую часть экстремо- фильных ферментов, которые нашли применение в промышленности, получают с использованием стандартных экспрессорных систем E.coli. Генетические «инструменты» для экспрессии продуктов в E.coli хорошо разработаны. В частности, получение термофильных ферментов сильно облегчается при денатурации большей части белков E.coli при коротком нагревании. Но образование инклузивных телец в клетках E.coli при сверхпродукции белка заставляет подыскивать других хозяев. Альтерна­тивными хозяевами могут быть бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Lactococcus, а из системы эукарий — дрожжи родов Pichia, Kluyveromyces, Candida и Hansenula. Необходимо учитывать специфику ге­терологичной хозяйской системы. Например, если для получения актив­ного фермента требуется его гликозилирование, то используют не бакте­риальный хозяин. В то же время для продукции внеклеточных ферментов хорошими хозяевами могут служить бактерии р. Bacillus.

Недостаток систем, основанных на бациллах, — высокий уровень протеаз, образуемых хозяином, что часто приводит к деградации гетеро­логичного генного продукта. Разработана система на основе B.brevis, дефицитного по протеазе, в которой неплохо экспрессировались гетеро­логичные белки. Показано, что гетерологичная экспрессия гипертермо­фильных экстремозимов сохраняет их свойства при высоких температу­рах (за небольшим исключением). С помощью методов молекулярной биологии и молекулярной инженерии возможно увеличение продукции архейных экстремозимов в их собственных хозяевах.

Выделение новых штаммов

Менее 1% архейных штаммов относится к культивируемым и, следовательно, доступным для изучения. Поэтому овладение культиви­рованием некультивируемых штаммов — главная научная задача, для ре­шения которой, в частности, необходимо изучение белок-транспортно- го аппарата. В отличие от хорошо изученного транспортного аппарата бактерий и эукариотов, архейная транслокация белков изучена еще недос­таточно. Предполагают функционирование у архей гибридного процесса бактериально-эукариотной системы с элементами архейной специфики.

Проникновение в биохимию, генетику и физиологию архей только начинается. Поэтому, несмотря на огромный экономический потенциал экстремозимов, большая часть его еще не реализована.