Теоретичні основи спектрофотометрії

Аналіз спектрів поглинання гемоглобіну

Мета роботи: вивчити спектри поглинання гемоглобіну, ознайомитися з теоретичними основами спектрофотометрії.

 

Теоретичні основи спектрофотометрії

 

При пропусканні світла через шар речовини його інтенсивність зменшується. Це є наслідком взаємодії світлової хвилі з електронами речовини, в результаті чого частина світлової енергії передається електронам, а молекули речовини переходять із основного енергетичного стану в збуджений. Таке явище називають поглинанням світла. Інтенсивність поглинання визначається числом переходів за одиницю часу молекул поглинаючої речовини з основного в збуджений стан.

В основі спектрофотометричних досліджень лежить закон Бугера-Ламберта-Бера. Нехай через однорідну речовину проходить пучок паралельних монохроматичних променів довжиною хвилі λ. Виділимо елементарну ділянку шару речовини товщиною dl:

 

 

 

При проходженні світла через таку ділянку його інтенсивність І послаблюється. Зміна інтенсивності dІ пропорційна інтенсивності падаючого світла і товщині шару dl:

, (3.1)

де κ_λ – монохроматичний натуральний показник поглинання, що залежить від властивостей середовища.

Знайдемо інтенсивність І_l світла, що пройшло через шар речовини товщиною l, якщо інтенсивність падаючого світла І₀. Для цього проінтегруємо рівняння (3.1), попередньо розділивши змінні:

.

В результаті отримаємо:

,

звідки:

. (3.2)

Це закон Бугера. Він показує, що інтенсивність світла зменшується в геометричній прогресії, якщо товщина шару зростає в арифметичній прогресії. Монохроматичний натуральний показник поглинання є величиною, оберненою віддалі, на якій інтенсивність світла послаблюється в е раз.

Монохроматичний натуральний показник поглинання розчину поглинаючої речовини в непоглинаючому розчиннику пропорційний концентрації с розчину (закон Бера):

κ_λ= κ₁·с, (3.3)

 

де κ₁ – натуральний показник поглинання, віднесений до концентрації речовини.

Закон Бера справедливий тільки для розведених розчинів. В концентрованих розчинах він порушується через вплив взаємодії близько розташованих молекул поглинаючої речовини. Підставляючи рівняння (3.3) в (3.2), одержуємо закон Бугера-Ламбетра-Бера:

 

, або . (3.4)

Відношення називається пропусканням; його значення можуть змінюватися від 0 до 1. Часто цю величину виражають у відсотках. Якщо величина τ віднесена до шару речовини товщиною 1см, тоді її називають коефіцієнтом пропускання.

Оптична густина речовини дорівнює:

. (3.5)

З рівнянь (3.4) і (3.5) одержуємо:

. (3.6)

Якщо концентрацію розчину виражають в молях на літр, то натуральний показник поглинання, віднесений до концентрації речовини, називають молярним коефіцієнтом поглинання і позначають ε. В цьому випадку формула (3.6) приймає вигляд:

. (3.6)

Молярний коефіцієнт поглинання чисельно дорівнює оптичній густині розчину з молярною концентрацією 1 моль/л і товщиною 1 см. Кількісне визначення речовини за спектрами поглинання можна проводити в тому випадку, якщо досліджуваний зразок задовольняє вимоги закону Бугера-Ламберта-Бера:

- поглинаючі молекули розподілені по об’єму зразка рівномірно;

- поглинаючі молекули в інтервалі досліджуваних концентрацій не міняють характеру взаємодії одна з одною і з молекулами середовища;

- при проходженні через зразок світловий потік послаблюється тільки за рахунок поглинання фотонів;

- світловий потік не викликає фотохімічних змін поглинаючих молекул.