Лабораторная работа № 2 «Изучение механизма действия витаминзависимых ферментов на примере оксидоредуктаз»

Присутствие окислительно-восстановительных ферментов в растительных и животных тканях и биологических жидкостях может быть обнаружено по их действию на соответствующие субстраты.

Задание 1. Окисление тирозина молекулярным кислород в присутствии тирозиназы (катехолоксидазы). Тирозиназа относится к группе оксидаз и катализирует окисление одноатомных и многоатомных фенолов (орто -дифенолы) и родственных им соединений (групповая специфичность) кислородом воздуха. По химической природе тирозиназа является металлопротеидом, содержащим медь в количестве 0,20-0,25%. Медь является необходимым компонентом активного центра фермента и действует как переносчик электронов в процессе окисления и восстановления. Тирозиназа находится в отдельных тканях и органах и широко распространена в растениях и грибах.

В организме животных и человека тирозиназа катализирует превращение адреналина в физиологически неактивный пигмент адренохром. Последний, конденсируясь, превращается в бурый пигмент меланин. Бронзовый цвет кожи при заболевании надпочечников (аддисонова болезнь) обусловлен образованием избыточного количества меланина.

Ход работы. Мелкоизмельченный картофель в количестве 0,5-1 г растирают в фарфоровой ступке с 3 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли. Фильтрат содержит фермент тирозиназу.

В две пробирки наливают по 1 мл вытяжки из картофеля, содержащей фермент тирозиназу. Содержимое одной пробирки кипятят 1-2 минуты и охлаждают в стакане с холодной водой. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл насыщенного раствора тирозина, перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 40-45 ^оС. Каждые 5 минут пробирки вынимают и содержимое их сильно встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости в пробирках с воздухом. Жидкость в пробирке с активным ферментом постепенно принимает сначала розовую, красную, а через 1-2 часа – бурую и черную окраску. В контрольной пробе с прокипяченной вытяжкой цвет жидкости не изменяется (почему?).

Реакция обусловлена окислением тирозина кислородом воздуха и протекает благодаря каталитическому действию тирозиназы. В процессе окисления из тирозина образуется красный пигмент галахром, который затем превращается в темный пигмент, родственный естественным меланинам.

Задание 2. Окисление формальдегида метиленовой синью в присутствии альдегиддегидрогеназы (ксантиноксидазы) молока. Альдегиддегидрогеназа, или ксантиноксидаза, относится к аэробным дегидрогеназам (акцептором электронов и протонов служит кислород) и катализирует окисление гидратированной формы гипоксантина в ксантин, а также ксантина в мочевую кислоту. По химической природе ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден. В отличие от оксидаз геминовой природы (цитохромоксидаза) и тирозиназы, катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекул воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом реакции является перекись водорода.

При определенных условиях альдегиддегидрогеназа может передавать электроны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В анаэробных условиях фермент способен окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др.

Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а также в других тканях растительного и животного происхождения.

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл свежего молока, в третью – прокипяченного и охлажденного молока. В первую и третью пробирки добавляют по 1 капле смеси 0,4%-ного раствора формальдегида и 0,02%-ного раствора метиленовой сини, во вторую – 1 каплю 0,02%-ного водного раствора метиленовой сини. Жидкость во всех трех пробирках должна быть окрашена одинаково в негустой голубой цвет. Во все три пробирки добавляют по 5 капель вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха (создание анаэробных условий) и помещают в водяную баню при температуре 40 ^оС. Через некоторое время жидкость в первой пробирке обесцвечивается.

Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и протекает благодаря каталитическому действию фермента альдегиддегидрогеназы.

Вследствие отсутствия активного фермента в прокипяченной пробе (третья пробирка) и субстрата в одной из некипяченых проб (вторая пробирка) обесцвечивания метиленового синего не происходит. Реакцией на альдегиддегидрогеназу можно отличить сырое молоко от кипяченого.

Задание 3. Окисление пирогаллола перекисью водорода в присутствии пероксидазы. Пероксидазами называются ферменты, которые катализируют окисление некоторых фенолов, полифенолов и ароматических аминов перекисью водорода или органическими перекисями.

Участвующая в реакции перекись водорода образуется в организме в результате действия некоторых оксидаз флавиновой природы (ксантиноксидаза). Органические перекиси возникают при окислении кислородом воздуха легко окисляющихся веществ, например, терпенов, каротиноидов и непредельных жирных кислот.

По химической природе пероксидаза является геминовым ферментом (в состав простетической группы входит железопорфирин) и содержит одну гематиновую (Fe³⁺) группу на молекулу фермента. Пероксидаза широко распространена почти во всех растительных клетках. В организме человека и животных слабой пероксидазной активностью обладает гемоглобин, миоглобин, цитохромы.

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 0,5 мл 2%-ного водного раствора пирогаллола и добавляют: в первую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена (содержит фермент пероксидазу) и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, во вторую – 0,5 мл прокипяченной и охлажденной вытяжки из хрена и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в третью – 0,5 мл дистиллированной воды и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в четвертую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена. Содержимое всех пробирок взбалтывают и наблюдают, что красный (возможно желто-бурый) осадок пурпургаллина образуется только в той пробирке (первая пробирка), где присутствуют донатор (пирогаллол) и акцептор водорода (перекись водорода) и активный фермент – пероксидаза.

Реакция обусловлена окислением пирогаллола перекисью водорода с образованием пурпургаллина – нерастворимого вещества красного цвета.

Задание 4. Разложение перекиси водорода каталазой крови. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. При этом одна молекула перекиси водорода окисляется и служит донором электронов, а другая восстанавливается и является акцептором электронов.

По химической природе каталаза является геминовым ферментом и содержит четыре гематиновые группы на молекулу фермента. Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, в большом количестве находится в эритроцитах. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода путем разрушения ее на воду и молекулярный кислород. Следует отметить, что если перекись водорода не удаляется из сферы окислительно-восстановительной реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается. В разрушении перекиси водорода принимает участие и пероксидаза.

Ход работы. В пробирку наливают 0,5 мл 1%-ного раствора перекиси водорода и добавляют 1 каплю крови. Происходит бурное выделение кислорода: жидкость вспенивается, и пена заполняет всю пробирку.

Таблица

Окислительно-восстановительные ферменты

 

Название фермента	Химическая природа простети-ческой группы	Биологи-ческий материал, содержащий фермент	Окисляющееся вещество (донатор водорода)	Восстанав-ливающееся вещество (акцептор водорода)	Продукты реакции и их окраска

 

Выводы:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Тесты для самопроверки и контроля знаний:

1. Что такое ферменты?

а) неорганические катализаторы клеток;

б) органические соединения, которые могут возбуждать новые реакции;

в) ингибиторы химических реакций;

г) биологические катализаторы белковой природы.

2. Что такое энергия активации?

а) энергия, необходимая для перевода всех молекул одного моля соединения в активное состояние при определенной температуре;

б) энергия, необходимая для разрыва (синтеза) химических связей во взаимодействующих молекулах;

в) энергия, необходимая для активации одной из взаимодействующих молекул;

г) энергия, необходимая для взаимодействия електронейтральных молекул.

3. Что такое энергетический барьер реакции?

а) минимальная энергия, необходимая для активации взаимодействующих молекул;

б) запас энергии, достаточный для преодоления сил отталкивания между реагирующими молекулами;

в) энергия, необходимая для запуска биоэнергетической реакции;

г) энергия, ниже чем потенциальная энергия взаимодействующих молекул.

4. Каким образом фермент понижает энергию активации?

а) увеличением количества свободных зарядов у взаимодействующих молекул;

б) увеличением энергетического барьера реакции;

в) образованием промежуточных субстрат-ферментных комплексов;

г) увеличением количества активных молекул, которые становятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне.

5. Чем отличаются простые ферменты от сложных?

а) простые ферменты состоят из полипептидных цепей и в последствии гидролиза расподаются только на АК, а сложные, кроме АК, содержат небелковый компонент;

б) простые ферменты являются простыми белками, а сложные — сложными;

в) простые ферменты являются термостабильными, а сложные — термолабильными;

г) простые фементы содержат АК и НК, а сложные — также простетические другие группы.

6. Что такое апофермент?

а) витамин;

б) белковая часть сложных ферментов;

в) гормоны;

г) кофакторы ферментов.

7. Что такое простетическая группа двухкомпонентного фермента?

а) небелковая часть фермента, которая легко диссоциирует с комплексом содержащим апофермент;

б) витамины;

в) белковая часть фермента;

г) небелковая часть фермента, которая крепко связана с белком-носителем.

8. Какая часть фермента определяет его специфичность?

а) апофермент и кофермент;

б) кофермент;

в) апофермент (белковая часть);

г) в одинаковой степени апофермент и кофермент.

9. Какие основные функции апофермента?

а) усиливает каталитическую активность небелковой части и определяет спецефичность действия фермента;

б) определяет спецефичность фермента;

в) принимает участие в акте катализа и стабилизирует кофермент;

г) отвечает за связь между коферментом и субстратом.

10. Какие вещества и факторы являются активаторами ферментов?

а) минеральные и органические кислоты;

б) SH-содержащие соединения, ионы тяжелых металлов;

в) оптимальная температура, буферные растворы, ионы одновалентных (ионы двухвалентных) металлов;

г) ионы двухвалентных (ионы одновалентных) металлов, соляная кислота, желчные кислоты, SH-содержащие соединения.

11. Какая температура являетя оптимальной для действия большенства ферментов?

а) 28-32 ^оС;

б) 37-43 ^оС;

в) 45-50 ^оС;

г) 50-60 ^оС.

12. Как изменяется состояние ферментов при низких температурах (около 0 ^оС)?

а) полностью разрушаются (денатурируется);

б) частично денатурируются с дальнейшей инактивацией;

в) не разрушаются, но практически полностью теряют активность;

г) не денатурируются, но полностью теряют активность.

13. Что такое абсолютная спецефичность фермента?

а) способность катализировать превращения только одного субстрата;

б) способность катализировать разрыв одной первичной связи;

в) способность катализировать превращения одной определенной группы субстратов, похожих по структуре коферментов;

г) способность катализировать превращения всех субстратов.

14. Что такое относительная спецефичность ферментов?

а) способность катализировать превращения одной определенной группы субстратов;

б) способность катализировать превращения только одного субстрата;

в) способность катализировать превращения группы близких по свойствам субстратов с определенным типом связи;

г) способность катализировать превращения общей группы стереоизомеров.

15. Что такое стереохимическая спецефичность ферментов?

а) способность катализировать превращения цис- или транс-стереоизомеров;

б) способность катализировать превращения D- или L-стереоизомеров;

в) способность катализировать превращения только одного стереоизомера;

г) способность катализировать превращения соединений D-ряда.

Тема «Водорастворимые витамины, как составная часть каталитических центров энзимов. Роль жирорастворимых витаминов, как регуляторов, структурных элементов клеток и организма человека в целом»

Витамины – это группа биологически активных веществ, синтез которых преимущественно происходит в бактериях и растениях (животные и человек витамины получают с пищей), являющихся предшественниками кофакторов или простетических групп; недостаток витаминов вызывает у животных и человека развитие симптомов гипо- или авитаминозов, а их избыток – гипервитаминоза. Витамины условно можно разделить на растворимые в полярных (водорастворимые: В₁, В₂, В₃, В₄, В₅, В₆, В₈, В₁₂, В_13, В₁₅, В_с, С, Р, PР, H, U, N, убихинона, ПАБК) и непо­лярных (жирорастворимые: A, D, Е, К, F) растворителях; в составе коферментов НАД⁺, НАДФ⁺ присутствуют одна из форм витамина В₅ (никотинамид), никотиновая кислота (ниацин, витамин РР) также может восполнить недостаток витамина В₅; ФМН и ФАД содержат в своем составе витамин В₂ (рибофлавин). Эти коферменты (простетические группы) входят в состав оксидоредуктаз, КоА – В₃ (пантотеновая кислота) входит в состав трансфераз, тиаминпирофосфат – В₁, (тиамин) - лиаз, пиридоксальфосфат – В₆ (пиридоксин) входит в состав трансфераз и лиаз; в со­ставе активных центров ферментов содержатся в качестве простетических групп ви­тамины: липоевая кислота у липоатацетилтрансферазы, витамин Н (биотин) у пируват- и ацетил-КоА-карбоксилаз, витамин К (филлохинон) у филлохинонредуктазы и менадионредуктазы, витамин В_с (фолиевая кислота) у трансаминаз, В₁₂ (кобаламин) у метилтрансфераз; кроме этого в составе белка родопсина присутствует витамин А (ретинол), участвующий в процессе фоторецепции; антиоксидантные свойства про­являют витамины: Е (токоферолы), Р (биофлавоноиды) и С (аскорбиновая кислота); в переносе ионов кальция участвует витамин D. Полиненасыщенные высшие жирные карбоновые кислоты (линолевая – ω6, линоленовая – ω3, арахидоновая - ω3) служат источником группы веществ регуляторной природы – эйкозаноидов.