Материально-техническое обеспечение методики определения карбогидрат-дефицитного трансферрина

Предпосылки и критерии выбора метода оценки CDT

В семидесятых годах прошлого столетия Stibler с соавторами при помощи метода изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) впервые выявили различия в составе изоформ трансферрина и идентифицировали аномальные гликоформы этого белка, характерные для лиц, злоупотребляющих алкоголем, впоследствии названные карбогидрат-дефицитным трансферрином (CDT) [116]. С тех пор были проведены и опубликованы результаты сотен исследований, касающихся различных аспектов клинического применения CDT и аналитических характеристик методов, позволяющих проводить измерение данного показателя.

Результаты опубликованных материалов, больших многоцентровых лабораторных валидационных и демонстрационных исследований показали, что диагностическая значимость маркера CDT и эффективность его практического использования определяется характеристиками лабораторного метода, лежащего в основе определения этого показателя. Низкие аналитические характеристики того или иного метода могут существенно снизить или полностью обесценить диагностическую значимость CDT [38, 40, 41, 43, 50, 64, 79, 115, 124]. В связи с этим практическое использование маркера CDT должно быть реализовано только теми диагностическими методами, чьи характеристики полностью удовлетворяют критериям, предъявляемым при их выборе.

При выборе лабораторного метода оценки показателя CDT, взятого за основу для разработки диагностического механизма, приведенного в настоящих Методических рекомендациях, учитывались следующие критерии:

1. Критерии, имеющие отношение к системе международной стандартизации CDT [80, 83, 84]:

1.1 Соответствие оцениваемого методом аналита текущему определению маркера CDT (до завершения международной стандартизации CDT);

1.2 Соответствие оцениваемого методом аналита новому определению CDT, выдвинутого рабочей группой IFCC по стандартизации CDT в 2007 г., и планируемого к включению в международные рекомендации в 2014-2015 гг.

1.3 Оценка CDT в единицах измерения (% CDT), рекомендованных рабочей группой IFCC по стандартизации CDT.

2. Критерии, имеющие отношение к техническим характеристикам метода:

2.1 Принцип метода и формат предоставления результатов, исключающие или минимизирующие необходимость подтверждения результатов исследования другими методами.

2.2 Возможность выявления факторов интерференции и обоснованного исключения из исследования проб пациентов, которые по своим биологическим особенностям не могут быть протестированы при помощи маркера CDT (некоторые генетические варианты трансферрина, 2-3-сиало-блок).

2.3 Исключение или минимизация «человеческого фактора» при проведении диагностической процедуры (автоматизация всех этапов исследования, включая пробоподготовку; полная прослеживаемость образца (работа с первичной штрих-кодированной пробиркой); отсутствие необходимости пользовательских корректировок (отсутствие ручных настроек, адаптаций, наличие унифицированного, запрограммированного протокола исследования).

2.4 Производительность (включая все этапы работы с пробой), достаточная для проведения скрининговых исследований.

3. Критерии, имеющие отношение к скрининговым характеристикам метода как инструмента скрининга:

3.1 Доступность метода для практического здравоохранения (наличие Регистрационного Удостоверения МЗ РФ и Сертификата соответствия ГОСТ Р на анализаторы и диагностические тест-системы; наличие в России сертифицированной сервисной службы, способной обеспечить ввод систем в эксплуатацию, их гарантийное и методическое сопровождение).

3.2 Приемлемость метода для обследуемых, исполнителей на всех уровнях и врачей.

3.3 Экономичность метода.

3.4 Возможность использования материально-технической базы метода в программах скрининга других социально-значимых и имеющих отношение к алкогольному генезу патологических состояний (нарушение белкового и углеводного обмена, хронические заболевания печени).

 

Сравнительные характеристики методов оценки CDT и обоснование целесообразности использования метода капиллярного электрофореза для проведения диагностических исследований на хроническое злоупотребление алкоголем

К настоящему времени разработан широкий спектр методов определения уровня CDT, среди которых практическое применение нашли методы непрямой и прямой иммунонефелометрии [37, 73, 80, 112], высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [37, 67, 68, 69, 74, 76, 81, 107, 121] и капиллярный электрофорез [48, 51, 52, 76, 90, 91, 98, 106, 109].

Сравнительная оценка, обзор литературных источников, анализ текущих положений и рекомендаций международной рабочей группы IFCC по стандартизации CDT показали, что, несмотря на относительную экономичность, иммунологические методы не являются приемлемыми для реализации диагностического механизма, взятого за основу в настоящих методических рекомендациях, т.к. обладают рядом существенных ограничений.

Основным из них является несоответствие оцениваемого иммунологическими методами аналита текущему (до завершения международной стандартизации CDT) и/или новому определению CDT, выдвинутого рабочей группой IFCC по стандартизации CDT в 2007 г. Так, методы непрямой иммунонефелометрии не позволяют полностью разделить низкосиалированные изоформы от высокосиалированных изоформ трансферрина, в т.ч. от трисиалотрансферрина, что противоречит текущему определению аналита, негативным образом отражается на аналитической специфичности маркера и повышает риск ложноположительных результатов [41, 43, 45, 59, 72, 80]. 

Метод прямой нефелометрии, представленный коммерческим тестом N Latex CDT производства [11, 17, 71, 88], использует антитела, направленные к углевод-дефицитным изоформам трансферрина (асиало, моносиало-, дисиало-), но не позволяющие изолированно детектировать изоформу дисиалотрансферрина [11, 53], что вносит существенные ограничения к использованию данного метода в рамках грядущей международной стандартизации CDT, в соответствии с которой первичным аналитом CDT будет утвержден дисиалотрансферрин [80, 84].

Более того, иммунологические методы требуют дополнительного измерения общей концентрации трансферрина для выражения результатов в рекомендованных IFCC единицах измерения %CDT, предоставляют результат в виде числового значения, что не позволяют визуализировать возможные факторы интерференции (генетические варианты трансферрина и пр.) и требуют обязательного подтверждения результатов при помощи разделительных методов [40, 42, 53, 66, 72, 76, 80, 86, 110, 114, 115, 124].

В связи с неэффективностью такого подхода иммунологические методы были исключены из диагностического механизма оценки CDT.

Разделительные методы – ВЭЖХ и капиллярный электрофорез – лишены недостатков иммунологических методов, позволяя детектировать, проводить визуальную и количественную оценку изоформ CDT как суммарно по всем углевод-дефицитным фракциям, так и изолированно по дисиалотрансферрину [67, 68, 74, 76, 81, 91, 121, 127]. В дополнение к этому разделительные методы позволяют выявлять возможные генетические варианты трансферрина, тем самым сводя к минимуму риск ложной трактовки результатов исследования [43, 52, 67, 69, 72, 79, 94, 98, 124].

Сравнительный анализ коммерческих производителей анализаторов и тест-систем определения CDT разделительными методами показал, что доступные российскому пользователю и разрешенные для диагностики in vitro ВЭЖХ системы не удовлетворяют критериям отбора в части технических характеристик. Основными ограничениями ВЭЖХ анализаторов являются длительная пробоподготовка, обусловливающая продолжительность исследования 1 образца свыше 60 минут, что делает метод непригодным для задач скрининга, а также необходимость индивидуальных пользовательских настроек и адаптаций в случае использования ВЭЖХ анализаторов различных производителей, что негативным образом отражается на такой характеристике, как воспроизводимость результатов и повышает межлабораторную вариабельность [30, 67, 74].

Наиболее приемлемыми с практической точки зрения являются анализаторы CDT методом капиллярного электрофореза. В настоящее время оценка CDT возможна при помощи коммерческих анализаторов трех производителей: Beckman Coulter (системы P/ACE 5000 и P/ACE MDQ) [15, 16, 20], Sebia (системы Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing) [10, 12, 13, 14, 51, 76, 98, 106, 109], Helena Bioscience (система V8) [9, 18, 19]. Исходя из данных Государственного реестра медицинских изделий и организаций, осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий, размещенных в открытом доступе сети интернет на сайте Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения по состоянию на 30 декабря 2013 г. системы капиллярного электрофореза производства Beckman Coulter не зарегистрированы и, таким образом, не могут использоваться в целях in vitro диагностики на территории РФ.

Системы капиллярного электрофореза Sebia и Helena Bioscience, а также расходные материалы к ним зарегистрированы и потому были допущены к оценке по вышеприведенным критериям.

Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализатора V8 производства Helena Bioscience, показала, что метод имеет ограничения по измерению такой углевод-дефицитной фракции, как асиалотрансферрин [9, 18, 19], что вызывает затруднения с последующей гармонизацией метода с международной системой стандартизации CDT, т.к. асиалотрансферрин рассматривается IFCC в качестве перспективного вторичного аналита [39, 80, 83].

Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении системы V8 производства Helena Bioscience не был включен ни в одно из опубликованных и/или находящихся в печати многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследований, проведенных в период с 2007 по 2013 гг. Более того, в последней публикации "Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: III. Performance of native serum and serum spiked with disialotransferrin proves that harmonization of CDT assays is possible», размещенной от имени рабочей группы IFCC по стандартизации CDT в 2013 г. в журнале Clinical Chemistry, равно как и в предыдущих публикациях рабочей группы, метод капиллярного электрофореза Helena Bioscience не фигурирует [80, 84].

 В полученных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма отзывы о методе капиллярного электрофореза Helena Bioscience также отсутствуют. Пилотных проектов по оценке аналитических характеристик и диагностической ценности метода Helena Bioscience в России на момент подготовки настоящих Методических рекомендаций выявить не удалось.

Очевидным недостатком анализатора V8 является также его высокая рыночная стоимость и ограниченное меню тестов (анализатор не позволяет проводить оценку маркера сахарного диабета) [9, 18, 19].

Таким образом, отсутствие доказательной базы и ограниченные функциональные характеристики не позволяют рекомендовать анализатор V8 производства Helena Bioscience для практического использования в диагностических программах по выявлению хронического злоупотребления алкоголем на территории Российской Федерации.

Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализаторов Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing производства Sebia, показала отсутствие ограничений как в отношении критериев, относящихся к системе международной стандартизации CDT, так и в отношении технических характеристик приборов. Метод Sebia позволяет разделять, визуализировать и проводить суммарную или пофракционную количественную оценку всех углевод-дефицитных фракций. Такой подход позволяет использовать данный метод в полном соответствии с текущим и рекомендованным определением аналита. Оценка результатов CDT проводится в относительных единицах (% CDT), что также соответствует выдвинутым рекомендациям IFCC и позволяет избежать интерференции со стороны колебаний общей концентрации трансферрина [10, 12, 13, 14, 51, 66, 79, 80, 86, 98, 106, 109, 110, 114, 124].

Технические характеристики метода капиллярного электрофореза Sebia также полностью соответствуют выдвинутым критериям оценки [98, 106, 109]. Оба анализатора обеспечивают полную автоматизацию исследования, включая пробоподготовку; обеспечивают полную прослеживаемость образца от момента взятия пробы до выдачи результата исследования (работа с первичной штрих-кодированной пробиркой), позволяют проводить визуальную оценку генетических вариантов трансферрина [10, 12, 13, 14, 79, 94, 98] и выявлять состояния, при которых применение маркера CDT должно быть ограничено (2-3-сиало блок) [10, 12, 65] или требуется специальная подготовка образца для снятия возможной интерференции со стороны иммуноглобулинов [48]. Время исследования одного образца, включая этап пробоподготовки, не превышает 13-15 минут, наличие двух анализаторов средней (Minicap) и высокой (Capillarys 2 Flex Piercing) производительности позволяет оптимизировать рабочие потоки в зависимости от условий конкретной лаборатории и масштабов скрининга.

Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении систем капиллярного электрофореза Sebia имеет положительный опыт участия в крупнейших многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследованиях, включая публикации рабочей группы IFCC по стандартизации CDT, где подтверждаются высокие аналитические характеристики данной технологии [84, 98, 106, 109]. Немаловажным преимуществом является участие систем Sebia в крупном эпидемиологическом исследовании на российской выборке [1, 97], пилотное трехлетнее испытание систем на базе Московского научно-практического центра наркологии, а также положительный опыт использования анализаторов Minicap на базе наркологических диспансеров Новосибирска, Краснодара, Казани, Чеченской Республики.

В предоставленных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма были получены положительные отзывы о методе капиллярного электрофореза Sebia.

Уникальным преимуществом рассмотренных анализаторов Sebia является возможность сочетания в одном приборе нескольких диагностически значимых скрининговых тестов, таких как оценка белковых фракций с возможностью выявления профилей хронического поражения печени и определение гликированного гемоглобина – ключевого маркера при диагностике и мониторинге сахарного диабета [35, 56]. Мультифункциональность данного метода позволяет оптимизировать экономические затраты на оборудование и расширить диагностическую панель, в т.ч. по таким социально-значимым и нередко алкоголь-ассоциированным нозологиям, как сахарный диабет [3, 32, 60, 118, 123] и болезни гепатобилиарной системы [27, 34, 36].

Таким образом, для достижения наибольшей диагностической эффективности, минимизации рисков неспецифического ответа и оптимизации экономической составляющей процедуры обследования рекомендовано использование систем капиллярного электрофореза Minicap и Capillarys 2 Flex Piercing производства Sebia.