Использование липосомальных векторов в генной терапии

Существуют различные подходы генной терапии для ингибирования, преодоления или использования механизмов резистентности. Прогресс в этой области и в генной терапии опухолей в настоящее время ограничен недостаточным развитием генно-векторной технологии для доставки нуклеиновых кислот. Для вирусных векторов характерны: канцерогенность, токсичность, иммуногенность, не специфичность, низкая экспрессия вирусных рецепторов на опухолевых клетках, а также сложная процедура создания. Использование липосомальной системы доставки более дешево. Однако эти системы опираются в основном на катионные липиды/липосомы для упаковки нуклеиновых кислот, которые являются более стабильными, чем нейтральные липосомы, созданные для эффективной длительной циркуляции. Конструкции, содержащей ген, необходима стабильность для проведения успешной генной терапии, более того, добавление фрагментов антител или других лигандов к конструкции может позволить сделать генную доставку более специфичной и эффективной.

Генная терапия на основе липосом включает подходы, при которых возможно прямое воздействие на механизмы лекарственной резистентности [71, 104]. Например, использование катионных липосом для доставки антисмысловых олигонуклеотидов или рибозимов против сиквенсов MDR1 гена, а также использование технологии генной терапии для гиперэкспресси генов лекарственной резистентности в нормальных тканях, для защиты тканей от токсического действия химиотерапии [123, 15, 83]. Например, ген MDR1 трансфецированный посредством липосомальных векторов в гематопоэтические предшественники в костном мозге [14].

Олигонуклеотиды сконструированы для того, чтобы смодулировать передачу генетической информации, но механизмы, с помощью которых олигонуклеотиды могут индуцировать биологический эффект, сложны. Для того чтобы антисмысловые олигонуклеотиды снижали экспрессию гена, он должен проникнуть в клетки мишени. Данные о точных механизмах, вовлеченных в этот процесс не ясны. Захват происходит через активный транспорт, который в свою очередь зависит от температуры, структуры и концентрации олигонуклеотидов и линии клеток [78, 128, 135]. Многочисленными работами было продемонстрировано, что олигонуклеотиды плохо интернализуются в клетках вне зависимости от того отрицательно они заряжены или нет, а также обязательным условием для действия антисмысловых олигонуклеотидов является, по-видимому, их ядерная локализация [54, 22]. Для того чтобы улучшить клеточный захват и активность антисмысловых олигонуклеотидов используют транспортеры, такие как липосомы. Использование этих транспортеров позволяет увеличить стабильность олигонуклеотидов от разрушения нуклеазами и позволяет использовать их меньшие концентрации.

Нуклеиновые кислоты могут легко инкапсулироваться в липосомы, которые содержат водное пространство, либо могут быть связанными с липосомальной поверхностью электростатическими взаимодействиями. Эти векторы, из-за их положительного заряда, имеют высокую аффинность к мембранам клеток, которые отрицательно заряжены при физиологических условиях [119].

Вс1-2 - важный антиапоптотический белок, который определяется в различных человеческих опухолевых клетках. Его ингибирование может теоретически вызывать чувствительность клеток к цитотоксической химиотерапии, что было показано в ряде последних исследований на тканевых культурах и экспериментальных моделях, которые привели к началу клинических испытаний [59].

Гиперэкспрессия Вс1-2 наблюдается при многих видах новообразований. Вс1-2 повышен приблизительно в 35% опухолей у больных раком предстательной железы [86, 21]. При гиперэкспрессии белка bcl-2 в опухолевых клетках простаты LNCaP увеличивался их in vivo туморогенный потенциал и появлялась резистентность к апоптозу [108]. Экспрессия Вс1-2 в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы является низкой или отсутствует.

Первоначально, антисмысловые фосфодиестер и фосфоротиоат олигонуклеотиды к мРНК bcl-2, использовались для ингибирования роста клеток в культуре 697 человеческой лейкемии [112]. Мишенью олигонуклеотидов является сайт инициации трансляции человеческого мРНК bcl-2. Оба класса олигомеров уменьшают клеточную пролиферацию: фосфоротиоаты более сильные ингибиторы, эксперименты с фосфодиестером в настоящее время потеряли свою значимость. Предполагалось, что фосфоротиоат bcl-2 антисмысловые олигонуклеотиды индуцируют клеточную гибель через взаимодействие со специфическими участками [26, 45].

Препарат G3139, представляющий собой фосфодиестер и фосфоротиоат антисмысловые олигонуклеотиды, направленные против первых шести кодонов Bcl-2 мРНК (G3139, Genta, Inc., Lexington, Mass.), был успешно использован на клетках Неходжскинской лимфомы. Молекулярная масса G3139 - 579,99. Он нестабилен в растворах со значением рН менее 3 или выше 7. Предполагаемое специфическое уменьшение уровня Вс1-2 мРНК через один день после обработки было продемонстрировано Kitada и соав. в клетках SU-DHL-4 [69]. Соизмеримое уменьшение в уровне белка Вс1-2, наблюдалось только после трех дней, по-видимому, из-за длительного периода жизни белка Вс1-2, что было связано с сильным снижением клеточной жизнеспособности. Обработка клеток лимфомы RS11846 препаратом G3139 приводила к уменьшению экспрессии Вс1-2 и увеличени. чувствительности этих клеток к АгаС и метотрексату [70]. При этом использовалась чрезвычайно высокая концентрация олигонуклеотидов.

Обработка опухолевых клеток LNCaP и опухоли Шионоги in vitro G3139 ингибировала экспрессию Вс1-2, что зависело от дозы и специфичности последовательностей [50, 89]. Авторы использовали катионный липид липофектина для доставки и измеряли уровни bcl-2 белка и мРНК. Однако они использовали только одиночный контроль олигонуклеотида, который уменьшает достоверность эксперимента. В других экспериментах, антисмысловые олигонуклеотиды существенно усиливали чувствительность к паклитакселу и доцетакселу, причем усиление действия препаратов зависело от их дозы. Характерные апоптотические изменения были обнаружены только после комбинированного лечения, а не после использования одного Вс1-2 олигомера [37, 51].

В настоящее время фосфоротиоат олигонуклеотиды (G3139) изучаются при введении внутривенно или интроперитонеально у пациентов, которые принимают участие в клинических испытаниях [13, 60]. Эти олигонуклеотиды стабильны в течение 48 часов, к этому времени их уровни все еще могут определяться в тканях. После внутривенного введения G3139 в дозе приблизительно 5 мкг/кг, элиминация в плазме составляет 22ч [34, 35, 111, 133].

Данные клинических исследований дают основания для дальнейшего клинического развития G3139, как монотерапии, так и в комбинации с другими цитотоксическими препаратами [29, 36, 64, 65, 91, 130, 131]. G3139 в настоящее время проходит I/II фазы испытаний у пациентов с андроген-независимым раком предстательной железы, которым назначают G3139 в комбинации с доцетакселом. Клинические испытания других нозологии опухолей планируются [29, 91]. Эффективность этого препарата в клинике в настоящее время обнадеживает, так как его токсичность относительно низкая, состоит, главным образом, в утомлении и тромбоцитопении.