Исследования in VItro

Методы исследования гормонов.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

Биологические определения могут выполняться на моделях in vivo или in vitro путем оценки действия постепенно меняющихся доз препарата сравнения или стандарта и интерполяции физиологиче­ского эффекта, вызываемого гормоном, количеством которого в пробе неизвестно. Как правило, в качестве относительно специ­фичного показателя оценивают определенную реакцию, на дейст­вие гормона. Например, сравнивают реакцию массы органа-мише­ни на действие различных доз неизвестного и стандартного гормо­нального препарата. Для того чтобы результаты определения имели силу, кривые доза—реакция для препарата сравнения и не­известной пробы должны быть параллельными. Демонстративным примером служит биологическое определение активности ЛГ и ХГЧ in vivo по влиянию на массу вентральной части предстатель­ной железы. Лютеинизирующий гормон (гормон гипофиза) и ХГЧ (плацентарный гормон) обладают неотличимой биологической активностью. При этом исследовании постепенно увеличивающие­ся количества экстракта мочи вводят подкожно в дробных дозах гипофизэктомированным неполовозрелым самцам крыс на протя­жении нескольких дней и в конце этого периода определяют массу вентральной части предстательной железы. Точно так же вводят постепенно увеличивающиеся дозы препарата сравнения, обладающего известной удельной биологической активностью ЛГ или ХГЧ, и массу вентральной части предстательной железы сравни­вают с таковой у животных, получавших неизвестный препарат. Этот биологический метод адекватен для определения биологиче­ской активности как ЛГ, так и ХГЧ, поскольку оба гормона сти­мулируют синтез и секрецию тестостерона клетками Лейдига крысы, что в свою очередь через ряд биохимических этапов приводит к увеличению размеров вентральной части предстательной железы животного. Увеличение массы этого органа пропорционально коли­честву тестостерона, выделяемого семенниками, стимулированны­ми ЛГ и ХГЧ. Гипофизэктомированных животных используют для того, чтобы исключить синтез и секрецию тестостерона в ответ на эндогенный Л Г. Этот метод является одним из классических и все еще применяется для характеристики препаратов ЛГ и ХГЧ. Он был впервые предложен более 40 лет назад Greep и соавт., а впо­следствии модифицированы.

Поскольку наклоны кривой доза-реакция от одного биологиче­ского определения к другому могут значительно варьировать даже при использовании одного и того же препарата, то каждый раз при определении необходимо производить статистический анализ на параллелизм между наклонами и однородностью отклонений кривых доза—реакция для стандарта или препарата сравнения и неизвестного препарата. В идеальном случае следует определить эффект не менее, чем в 3 достаточно отдаленных друг от друга точ­ках кривой доза—реакция с использованием проб от 3—5 животных на каждую точку для стандартного и неизвестного препарата. Только при параллелизме и гомогенности отклонений между стан­дартом и испытуемым препаратом можно сделать достоверный вывод о биологической активности и ее доверительных границах применительно к испытуемому препарату. При отсутствии такого параллелизма об активности испытуемого препарата судить нель­зя. Легко убедиться, что при биологических исследованиях любого типа не должно определяться действие в одной точке.

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO

Большинство методов in vivo требует относительно больших объе­мов плазмы, мочи или тканевых экстрактов, содержащих достаточ­ное количество гормона, чтобы вызвать значимый биологический эффект. В связи с этим подобные исследования, хотя они очень важны для исходной характеристики различных гормональных препаратов, оказываются непригодными для рутинного клиниче­ского применения. За последние несколько лет разработаны раз­личные методы биологического исследования in vitro. Они не толь­ко специфичны, но и требуют значительно меньших объемов тка­невых экстрактов или биологических жидкостей, что отражает их большую чувствительность. К сожалению, такие методы требуют уровня квалификации, пока еще не доступного для большинства лабораторий, осуществляющих рутинные клинические анализы.

Как правило, критерием сравнения служат различные дозы известного гормонального препарата, по отношению к которым можно интерполировать реакцию, вызываемую неизвестной про­бой. Различные дозы или объемы неизвестной пробы исследуют в той же самой системе наблюдения, а варианты реакции как на не­известный препарат, так и на препарат сравнения или стандарт анализируют на параллелизм и гомогенность отклонений. Послед­нее требование обязательно для любых определений гормонов как in vivo, так и in vitro.

Примером биологической системы in vitro служат клетки Лей­дига, или интерстициальные клетки. Под влиянием стимуляции ЛГ пли ХГЧ клетки Лейдига синтезируют и секретируют тестостерон в количестве, зависимом от дозы стимулирующего гормона. С помо­щью известных методик [3] клетки Лейдига можно отделить от семенных канальцев. Эти клетки равномерно распределяют по пластинкам для клеточных культур и стимулируют различными концентрациями стандартных препаратов ЛГ и ХГЧ и различны­ми объемами неизвестной пробы. Тестостерон секретируется в культуральную среду, и его концентрация определяется специфи­ческим радиоиммунологическим методом.

При биологических исследованиях in vitro могут использовать­ся различные показатели; к ним относятся изменения концентра­ции стероидов, ферментов или циклических нуклеотидов. Вообще говоря, определения in vitro более чувствительны, чем соответству­ющие им определения in vivo, и требуют значительно меньших объемов экстрактов сыворотки, ткани или мочи. Однако при ин­терпретации результатов биологического исследования in vitro необходима особая осторожность, поскольку в такой системе гор­мон может быть биологически активным, a in vivo оказывать очень слабое действие. Это расхождение отражает тот факт, что гормон должен не только связываться со специфическим участком клеточ­ной поверхности и «запускать» определенную последовательность биохимических сдвигов, но и быть доставленным к соответствую­щим клеточным рецепторам в высокой концентрации, чтобы насы­тить достаточное для воспроизведения эффекта число рецепторов. В некоторых случаях в силу будто бы небольших модификаций структуры гормона его клиренс может изменяться в значительной степени.

Для того чтобы гормон вступил во взаимодействие с рецепто­ром, он должен быть биологически активным, т. е. иметь соответ­ствующую конформацию для связывания специфическим рецепто­ром с высоким сродством или прочностью связи. Однако гормон может быть биологически активным in vitro, но не обладать значи­тельной биологической активностью in vivo в силу измененного из-за своих структурных особенностей метаболического клиренса. При исследовании биологической активности десиалилированного ХГЧ in vivo и invitro обнаруживаются существенные расхождения ее [4—7]. После лишения молекулы ХГЧ сиаловой кислоты (десиалилация) in vitro гормон оказывает такой же, если не больший, биологический эффект, что и его нативная, полностью сиалилированная молекула [6, 7]. С другой стороны, in vivo он проявляет очень небольшую биологическую активность, отражающую сте­пень десиалилации его молекулы. Это расхождение определяется значительно более коротким периодом полужизни десиалилированного ХГЧ в плазме по сравнению с интактным гормоном [5]. В свя­зи с этим десиалилированный ХГЧ in vivo достигает своих клеток-мишеней в концентрации, недостаточной для воспроизведения значительного биологического эффекта.

Методы определения одного и того же гормона в системах in vitro обычно более чувствительны, чем в системах in vivo. Неко­торые методы биологического исследования in vitro обладают даже большей чувствительностью, чем радиоиммунологические методы определения концентрации гормона. Методы биологического ис­следования in vitro, в которых в качестве показателя эффекта используются не специфическое рецепторное связывание или ак­тивация аденилатциклазы, а другие биохимические процессы, обычно в десятки, а то и сотни раз более чувствительны, чем радиоиммунологические методы. Методы биологического определения гормонов in vitro в настоящее время не входят в число рутинных способов оценки состояния больного, за исключением тех редких случаев, когда можно предположить расхождение биологической и иммунологической активности гормона.