Бактериологическое для исследования
Лабораторная диагностика столбняка
Таблица 60 - Ферментативные свойства C.botulinum
Тип | Признаки | Тип токсина | ||||||||
Лецитиаза | Липаза | Желатиназа | Казеиназа | Индол | Глюкоза | Лактоза | Сахароза | Мальтоза | ||
-_ | + | + | + | - | + | -_ | - | + | A, B,F | |
- | + | + | -_ | - | - | -_ | - | + | В, Е, F | |
± | + | + | - | ± | + | - | - | ± | C,D | |
- | - | + | + | - | - | н.д. | - | н.д. |
— варьирующий признак н.д. — нет данных
Столбняк — остропротекающая инфекционная болезнь животных и человека, характеризующаяся судорожными сокращениями мускулатуры в результате воздействия токсина возбудителя. Возбудитель болезни —
C. tetani.
Лабораторный диагноз устанавливают на основании обнаружения в исследуемом: материале токсина возбудителя, а также выделения культуры возбудителя и выявления у нее токсигенных свойств. С учетом характерных клинических признаков болезни, нередко ограничиваются при постановке диагноза изучением клиники и анамнестических данных.
|
|
Прижизненно для исследования направляют раневой секрет, фрагменты тканей из глубоких слоев мест поражения; посмертно — ткани из мест поражения, кусочки печени, селезенку, кровь.
Микроскопическое исследование исходного материала. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму, микро-скопируют. В положительных случаях находят тонкие грамположительные палочковидные клетки размером 0,4-0,6x4-8 мкм, с характерными терминально расположенными спорами («барабанная палочка»), которые в 2-3 раза толще клетки; капсулы нет. Результаты микроскопического исследования имеют ориентировочное значение, так как с возбудителем морфологически сходны С. tetanoides и С. tetanomorphum.
Обнаружение токсина в исследуемом материале. Исследуемый материал растирают со стерильным песком в ступе с физиологическим раствором (1:2). Половину взвеси экстрагируют при комнатной температуре в течение часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтратом заражают подкожно в заднюю лапку 2 белых мышей (масса 16-18 г) в дозе 0,5-1 мл. Второй группе мышей вводят 0,5 мл фильтрата и 500 ED столбнячного антитоксина. Животным третьей группы вводят фильтрат, прогретый при 100° С в течение 30 минут. Положительный результат: у мышей 2 и 3-й групп изменения должны отсутствовать, у мышей 1-й группы через 2-4 суток в положительных случаях появляются признаки тетанического сокращения мышц. Животные погибают с вытянутыми лапками, искривлением позвоночника в сторону лапки, в которую был введен исследуемый материал. За животными наблюдают в течение 10 суток. При выявлении токсина в материале работу по выделению культуры прекращают. В соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностики столбняка» (1983) предусмотрено заражение мышей фильтратом подкожно в заднюю лапку в дозе 0,5-1 мл или двух морских свинок массой 300-350 г в дозе 3-5 мл без предварительного прогревания фильтрата и без введения столбнячного антитоксина. Срок наблюдения за клиническим состоянием животных — 10 суток.
|
|
Выделение культуры C. tetani. Возбудитель — строгий анаэроб, температурный оптимум — 37-38° С, рН 7,2 -7,4.Вторую половину исследуемой взвеси (см. выше) прогревают в течение 20 минут при 80° С, затем засевают в среду Кита-Тароцци с 0,5% глюкозы, печеночный, мартеновский бульон со слоем вазелинового масла. Можно делать посев непрогретого материала в два культуральных сосуда, один из которых затем прогревают при 80° С в течение 20 минут. Параллельно прогретый материал высевают с целью получения изолированных колоний на кровяной агар с 1,5% и 3% агара в чашки Петри. Посевы культивируют в анаэростате с разрежением воздуха до 4 -5 мм ртутного столба или с заменой воздуха смесью Н2 и СО2 при 37 -38° С в течение 2-5 суток.
Через 2-4 дня просматривают посевы на плотных и жидких средах. На среде Кита-Тароцци рост возбудителя сопровождается ее интенсивным помутнением с небольшим газообразованием, позднее (2-3 суток) выпадает осадок, среда просветляется, культура имеет запах жженого рога.
На 3%-ном агаре Цейсслера С. tetani формирует круглые, бесцветные или серые колонии с неровными краями (ризоидные), на 1,5%-ном агаре (влажном) наблюдают характерный расползающийся, роящийся рост возбудителя. Может наблюдаться узкая зона β-гемолиза.
Из жидких питательных сред и подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. В положительных случаях находят в мазках тонкие грамположительные палочки с терминальными спорами, с возрастом клетки становятся грамвариабельными, вплоть до грамотрицательных. Если первичный посев производили только в жидкую питательную среду, то производят посев бульонной культуры на кровяной агар с целью получения изолированных колоний.
При обнаружении в жидких питательных средах бактериальных клеток, характерных для С. tetani, на 4-6-е сутки инкубирования определяют наличие в культуре токсина путем ее введения белым мышам, как было указано выше.
Основным направлением лабораторного исследования является обнаружение токсина, к идентификации выделенной культуры прибегают редко. Для C. tetani характерно отсутствие лецитиназы, липазы, казеиназы, возбудитель не образует кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы, гидролизирует желатину, индол образует не постоянно. Для целей идентификации удобно использовать тест-системы для анаэробов.