Микроскопическое исследование исходного материала
Бактериологическое исследование
Для микроскопического исследования готовят мазки-отпечатки из свежепораженных участков основы кожи копытец и слизи, покрывающей кожу межпальцевых щелей. Для биопробы материал берут из различных участков копытец и используют для постановки биопробы немедленно.
Для выделения культуры возбудителя и транспортировки жидкий материал отсасывают в стерильные шприцы, удаляют из них воздух, иглы сгибают. Посмертно отбирают кусочки свежепораженной ткани размером 2 см3. Материал можно также собирать стерильными тампонами, свободными от кислорода, стерилизованными во флаконах, заполненных азотом. Процедуру взятия материала такими тампонами проводят максимально быстро и затем тампон глубоко погружают в транспортную среду Cary-Blair. Кусочки тканей, шприцы с материалом помещают в специальные анаэробные контейнеры, пластиковые термостабильные контейнеры с газогенерирующим содержимым и индикатором анаэробных условий. Исследуемый материал хранят (транспортируют) при температуре выше 4-6° С. Все виды материалов необходимо исследовать в течение пяти часов.
|
|
Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, а также фуксином Циля (1:10) в течение 6-8 минут, поскольку бактероиды плохо воспринимают красители, окраска по методу Грама и изучение морфологии клеток в таких мазках затруднительна. В положительных случаях в поле зрения обнаруживают крупные (3-6х1,7 мкм) грамотрицательные палочковидные бактерии, прямые или слегка изогнутые, часто один или оба конца клетки утолщены и окрашены более интенсивно, чем остальная часть бактерии («гантелевидные» бактерии); располагаются одиночно или последовательно парно. Нередко клетки возбудителя окружены радиально отходящими мелкими грамотрицательными бактериями (феномен Бевериджа).
Наряду с B.nodosus в мазках в большом количестве присутствуют сопутствующие микроорганизмы (кокки, палочковидные клетки, спирохеты). Клетки F.necrophorum обычно длинные и нитевидные с характерной неравномерностью в окраске. Обычно в поле зрения обнаруживают не более 8-10 клеток возбудителя, и при хроническом течении болезни для выявления B.nodosus необходимо просмотреть несколько полей зрения. Эффективно использование на этой стадии исследования метода флуоресцирующих антител.
Культивирование. B.nodosus —строгий анаэроб, температурный оптимум 37-38° С, рН 6,7-7,2. Анаэробные условия создают путем удаления из анаэростата воздуха до разрежения 25 мм ртутного столба с последующим введением 5-10% С02, 5-10%) Н2 или азота с 10% Н2. Процедуру повторяют трехкратно. Для этой же цели могут быть использованы газ-пакеты. В обоих случаях используют в качестве индикатора анаэробиоза раствор метиленового синего, который при рН 7,0 и Eh 71 мВ полностью окислен (окрашен), а при Eh 49 мВ — восстановлен (бесцветный). Посев и культивирование осуществляют в соответствии с принципами Хангейта для строгих анаэробов. Агаровые среды в чашках Петри выдерживают в анаэробных условиях до посева в течение 8-24 часов и сразу же после посева помещают в анаэробные условия. Если такой возможности нет, чашки помещают в сосуд, продуваемый СО2 свободным от кислорода. Посевы проводят платиновыми или никелевыми, но не нихромовыми петлями. Пипетки, используемые для посева, предварительно заполняют стерильным газом. Манипуляции при посеве исследуемого материала на питательные среды осуществляют в потоке СО2 свободного от кислорода.
|
|
Первичные посевы производят на обогащенные плотные агаровые среды: кровяной (5%) агар на основе сердечно-мозгового, триптически-соевого агара, бруцелла-агара, плотной среды Бектемирова. К указанным средам в качестве стимулятора роста добавляют витамин К, гемин и дрожжевой экстракт. В качестве питательной селективной среды, а также для определения пигментообразования применяют Brucella-агар с канамицином, который добавляют до автоклавирования, ванкомицином и 5% лаковой крови. Последнюю получают путем трехкратного замораживания и оттаивания.
Посев на жидкие питательные среды особенно ценен, если по данным микроскопического исследования содержание В.nodus в материале невелико. Используют тиогликолатный бульон, среду Кита-Тароцци, мясо-пептонный бульон с глюкозой, в которые также вносят витамин К-геми-новую добавку. Жидкие среды перед посевом прогревают в кипящей водяной бане 15-20 минут, охлаждают и при посеве по возможности не встряхивают. Посев производят пастеровскими пипетками. Инкубирование проводят при 37° С до семи суток. При соблюдении оптимальных условий рост может наблюдаться уже через 48 часов.
Посевы на плотных средах начинают просматривать через 48 часов инкубирования в потоке обескислороженного СО2. Обращают внимание на образование пигмента на среде с лаковой кровью. На плотных питательных средах B.nodosus может формировать колонии трех типов: В, М и С. Колонии В-типа сосочковидные или сферические, обычно формируют вирулентные штаммы, выделяемые от овец. Мукоидные колонии (М-тип) образуют менее вирулентные штаммы от овец и крупного рогатого скота. Колонии С-типа — гладкие, появляются в результате пассирования культур на питательных средах и характерны для штаммов, утративших вирулентность. Часто в поверхности среды под колониями, после их снятия, обнаруживаются углубления. Колонии обычно имеют серо-белый цвет и через 3-7 дней инкубирования достигают диаметра 0,5-3,0 мм.
Размер и форма колоний зависят в определенной степени от состава и консистенции питательной среды. На кровяном агаре с 1,5% агар-агара большинство штаммов образуют мелкие (до 1 мм), гладкие, плоские, прозрачные, с выпуклым центром и неровными краями колонии. На аналогичной среде с 3% агар-агара тот же вирулентный штамм формирует более крупные (диаметр 1,5-2,0 мм) шероховатые колонии. Гемолитической активностью B.nodosus не обладает.
В среде Кита-Тароцци с 0,1% агар-агара B.nodosus растет в виде серовато-белых вертикально опускающихся тяжей. В аналогичной жидкой питательной среде возбудитель растет с ее равномерным помутнением. На указанных средах в анаэробных условиях могут расти факультативные анаэробы. Микроскопическое исследование мазков, окрашенных по Гра-му, позволяет дифференцировать B.nodosus от некоторых из них. Субкультуры из подозрительных колоний после микроскопического исследования твивают на тиогликолатный или мясной бульон с глюкозой.
|
|
Морфология клеток B. nodosus в культуре. В мазках из культур морфология клеток B.nodosus сходна с таковой у клеток в исследуемом материале. Возбудитель не образует жгутики, капсулу, споры. При окраске по Граму па стадии изучения первичных культур могут быть ошибочно приняты за B.nodosus грамположительные анаэробы, потерявшие способность к грамположительной окраске. Для избежания таких ошибок рекомендуется следующий тест: на предметное стекло в две капли КОН
(3%-ный, вес/объем) вносят бактериологическую петлю 48-часовой культуры изучаемой колонии с плотной среды и суспендируют на площади
2 см2. Если при этом формируются тянущиеся нити, то микроорганизм является грамотрицательным.