Выявление фосфатазы. Фосфатаза гидролизует фенолфталеина дифосфат в свободный фенолфталеин, что приводит к защелочению рН до 9-10. Питательная среда: PPLO-бульон — 74 мл, агар Дифко — 08 г. Смесь автоклавируют, охлаждают до 56° С, добавляют инактивированную сыворотку крови свиньи или лошади — 20 мл, дрожжевой экстракт (25%-ный раствор) — 10 мл, натрия фенолфталеин дифосфат (1%-ный раствор) — 1,0 мл, пенициллин (200 000 ед/мл) — 0,2 мл. Испытуемой культурой засевают в двух чашках Петри 72 площади среды, вторая половина служит контролем. После инкубации в течение 3 и 5 дней на поверхность опытной и контрольной частей чашки Петри вносят капли 5N NaOH. Наличие покраснения в течение 30 с расценивают как положительный результат. Для проверки качества среды используют посевы с M.bovis — положительный результат и M.arginini — отрицательный результат.
Ферментация глюкозы. Известно несколько способов определения ферментации глюкозы. Их общим недостатком является возможное снижение рН за счет присутствующих в среде сыворотки крови и дрожжевого экстракта, причем даже у микоплазм, не ферментирующих глюкозу. Чтобы избежать ошибок, из PPLO-среды исключают дрожжевой экстракт, снижают количество сыворотки до 1%, делают соответствующие контроли. Исследуемую культуру трижды пассажируют на основной среде для активизации. Посевы инкубируют в течение 14 дней. При учете результатов используют контроли в диапазоне рН от 8,2 до 6,0 с интервалом 0,2, при помощи которых и учитывают уровень закисления рН. Различия рН в опыте и контроле на 0,5 рН расценивают как положительный результат. При проведении данного теста в качестве базовой используют следующую питательную среду: PPLO-бульон — 70 мл, свежий дрожжевой экстракт (25%-ный раствор) — 10 мл, инактивированная сыворотка крови свиньи или лошади 10—20 мл, глюкоза (50%-ный раствор) — 1 мл, пенициллин (200 000 ед/мл) — 0,5 мл, феноловый красный (1%-ный раствор) — 0,4 мл. В качестве посевного материала берут 24-часовую бульонную культуру с хорошим ростом, которую в объеме 0,5 мл засевают в пробирку со средой, содержащей глюкозу, со средой без глюкозы. Кроме того, в качестве контролей инкубируют незасеянные среды с глюкозой и без глюкозы. В процессе инкубирования через 24 и 48 часов контролируют наличие роста. Если испытывается анаэробная культура, то поверхность среды заливают стерильным вазелиновым маслом. Как положительный результат принимают пожелтение среды вследствие ее закисления.
|
|
Определение уреазной активности. На поверхность колонии наносят реактив, состоящий из 10%-ной мочевины и 0,8% MgCl2 x 4H20, смешанных в равной пропорции. Колонии уреаположительных микоплазм окрашиваются в темно-коричневый, а позднее — черный цвет. Так же можно выявлять уреазу посевом культуры в жидкую питательную среду для уреаплазм, содержащую 1% мочевины (см. «Среда Ливингстона»). Контролем служат среды без мочевины, а также пробирки, засеянные уреазопозитивным штаммом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 5 суток. Защелочение рН среды на 0,5 ед. по сравнению с контрольным оценивают как положительный результат.
|
|
Разжижение желатины. Приготовление питательной среды. В 100 мл воды растворяют 2,5 г сердечного экстракта («Дифко»), 12 г желатины («Дифко»), устанавливают рН 7,6, разливают по пробиркам по 3 и 7 мл, автоклавируют при 121 °С в течение 10 минут, охлаждают и вносят в каждую пробирку 1 мл сыворотки крови лошади и 0,25 мл 25% дрожжевого экстракта. Проведение опыта. Исследуемую культуру и контрольный (положительный) штамм выращивают на агаровой среде, вырезают агаровый блок с колониями и переносят в пробирку с желатиновым субстратом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 30 суток. Результат учитывают с интервалом 14-15 суток, предварительно охладив пробирки при 4°С. В качестве контроля (отрицательного) инкубируют незасеянную пробирку.
Разжижение сыворотки. В качестве субстрата используют питательную среду следующего состава: 16 мл сердечного экстракта, автоклавированного при 121°С в течение 20 минут, 60 мл сыворотки крови лошади, 1,6 мл 25% дрожжевого экстракта, 2,4 мл стерильной воды (рН 7,8). Среду разливают по 2 мл в пробирки, подсушивают под вакуумом 20-30 минут, прогревают в скошенном положении текучим паром в течение 45 минут. В пробирки со средой вносят различные разведения исследуемой культуры и параллельно контрольной культуры, обладающей протеолитической активностью. Посевы инкубируют в течение 14—20 суток, просматривая каждые 2 дня. Положительный результат: появление на поверхности свернутой сыворотки просветлений, углублений, отверстий, полостей, небольшого количества жидкости.
Определение чувствительности к дигитонину. Исследуемую культуру разводят до 10 КОЕ/мл, 0,2 мл культуры засевают в виде стекающей капли на плотную оптимальную питательную среду, содержащую 10-20% сыворотки крови. Затем, после подсушивания в течение 10 минут, на зону посева помещают стерильный диск фильтровальной бумаги, пропитанный раствором дигитонина. Посев инкубируют в течение времени, необходимого для роста микоплазм, и измеряют зону задержки роста вокруг дисков. Представители семейства Mycoplasmataceae и Spiroplasmataceae растут не ближе 2-15 мм от диска. Рост ахолеплазм не ингибируется вообще, или зона задержки роста не более 1-1,5 мм. Приготовление дисков с дигитонином. Готовят 1,5%-ный раствор дигитонина в 95%-ном этаноле при подогревании в водяной бане. На диск из стерильной фильтровальной бумаги диаметром 6 мм наносят по 0,025 мл раствора дигитонина. Диски высушивают при 37°С и хранят при 4°С.
Определение потребности в холестерине. От стерола не зависят ахолеплазмы, требуют его для своего роста микоплазмы, уреаплазмы и спироплазмы.
Методы идентификации микоплазм
При росте некоторых видов микоплазм на плотных питательных средах образуется пленка и зерна. Пленка состоит из холестерола и фосфолипи-дов, зерна — из выпавших в осадок солей магния и кальция, что является следствием липолитической активности микоплазм в отношении жирных кислот. Для проведения данного теста расплавляют 75 мл агара с сердечным отваром («Дифко»), добавляют 20 мл сыворотки крови лошади, инактивированной при 56°С в течение 30 минут, 5 мл стерильного дрожжевого экстракта. До автоклавирования агаровой основы устанавливают рН 7,8, после автоклавирования агар охлаждают до 56° С, вносят остальные ингредиенты и разливают по чашкам Петри. Посевы инкубируют при 37°С. Использование стереоскопического микроскопа облегчает раннее обнаружение изменений. Не рекомендуется инкубирование посевов более двух недель, так как возможны ложные позитивные реакции.
|
|
Прямое определение потребности микоплазм в холестерине проводится следующим образом. Бульонную культуру микоплазм логарифмической стадии роста центрифугируют при 20 тыс. g в течение 20 минут. Осадок отмывают фосфатным буферным раствором (0,1М, рН 7,4). Взвесь микоплазм засевают на питательную жидкую среду без холестерина (1 мл взвеси на 9 мл среды) и 0,1 мл взвеси — на аналогичную агаровую среду. Посевы инкубируют и затем проводят пять пассажей на аналогичных средах. Ахолеоплазмы удается пассировать, микоплазмы и спироплазмы погибают через 1-2 пассажа.
Определение гемагглютинирующей активности. Бульонную культуру микоплазм троекратно отмывают фосфатным буферным раствором (0,1 М, рН 7,4) с 0,3 М фтористого натрия. В восемь пробирок (лунок планшета) вносят по 0,1 мл фосфатного буфера. В первую лунку добавляют 0,1 мл суспензии микоплазм и готовят последовательные двукратные разведения до 1:256. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл взвеси эритроцитов (1%). В контрольную пробирку вносят все компоненты, но вместо микоплазм — аналогичный объем буферного раствора.
Определение гемолитической активности. Исследуемую культуру выращивают на плотной питательной среде и заливают агаровой средой с эритроцитами. Чашки Петри заклеивают и инкубируют при 37° С трое суток с ежедневным контролем. Положительный результат: гемолиз вокруг колоний микоплазм. Используют эритроциты различных видов животных. Гемолиз может быть а - и β-типа.
Приготовление агаровой среды с эритроцитами. Эритроциты троекратно отмывают в фосфатном буферном растворе. Готовят 20%>-ную взвесь, готовят 3,5%-ную основу агаровой среды, разливают по 2 мл в пробирки, автокла-вируют, охлаждают до 50° С, вносят в пробирку 0,8 мл взвеси эритроцитов, перемешивают и используют.
Гидролиз казеина. Приготовление питательной среды. В 120 мл воды растворяют 2 г агара (Оксоид). Устанавливают рН 7,6, автоклавируют
15 минут при 121°С. Параллельно в 90 мл воды растворяют 8 г порошка снятого молока («Дифко»), устанавливают рН 7,6, автоклавируют при 121°С в течение 15 минут. Расплавляют агаровый компонент, смешивают с раствором молока и разливают по 2 мл в пробирки. Проведение опыта. Испытуемую культуру выращивают на агаровой среде, молочный агар расплавляют в водяной бане, охлаждают и несколько капель наносят на колонии испытуемой культуры. Посевы инкубируют при 37°С в течение 14 суток, результат учитывают через каждые 48 часов. Положительный результат: просветление молочного агара над колониями микоплазм.
|
|
Гидролиз аргинина. Базовая среда: PPLO-бульон (рН 7,0) — 70 мл, свежий дрожжевой экстракт (25%-ный раствор) —10 мл, инактивированная сыворотка крови свиньи или лошади —20 мл,
L-аргинин НС1 (10%-ный раствор) — 5 мл, пенициллин (200 000 ед/мл) — 0,5 мл, феноловый красный (1%-ный раствор) — 0,4 мл. Инокуляция питательных сред, сроки инкубирования, контроли и методы оценки изменения рН такие же, как и при изучении ферментации глюкозы. В качестве контролей используют засеянные пробирки с аргинином и без, незасеянные пробирки с аргинином и без него. Как положительный результат оценивают покраснение среды (защелочение).
Определение способности редуцировать тетразол. Агаровую культуру заливают 4 мл смеси из ионагара и трифенилтет-разолийхлорида аа (водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолий-хлорида и ионагара), инкубируют 4-5 часов при 35° С, результат учитывают через каждые 30 минут. Положительный результат — окрашивание колоний в красный, а затем — в пурпурный цвет за счет образования формазана.
Бульонная культура. Испытуемую культуру засевают в две пробирки с бульоном, содержащим 1% трифенилтетразолийхлорида, одну из пробирок заливают парафином, культивируют 14 суток при 37° С. Параллельно аналогичным образом поступают с двумя незасеянными пробирками (контроль). Положительный результат — красно-коричневое окрашивание среды в аэробных и анаэробных условиях (пробирка с парафином).
Реакция иммунофлуоресценции. Данный метод серологической идентификации микоплазм может быть использован в различных модификациях: окраска отпечатков колоний на предметных стеклах, препаратов из бульонных культур, колоний на дисках мембранных фильтров, микоплазм в гистосрезах, клеточных структурах. Общие принципы идентификации микроорганизмов прямым и непрямым методом иммунофлуоресценции изложены в разделе «Серологические реакции». Методика идентификации микоплазм в микроколониях на мембранных фильтрах описана в разделе «Микоплазмоз свиней». Наибольшее применение получил метод иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на плотных средах, который оценивают как более специфический, чем тесты ингибиции роста и метаболизма. Реакцию иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на агаровой среде (эпифлуоресценция) проводят следующим образом. В чашки с агаровой средой высевают дробно 0,1-0,2 мл бульонной культуры, инкубируют посевы при 37° С в течение 3-5 дней, вносят в чашку 2 мл буферного раствора на 30 минут, слива ют, вносят 2 мл меченой сыворотки (прямой вариант) в рабочем титре, выдерживают при 37° С 30 минут, сливают копъюгат, трижды промывают буферным раствором, после чего просматривают колонии под люминесцентным микроскопом. Колонии, связавшие гомологичные антитела, ярко флуоресцируют. При постановке реакции в непрямом варианте на первом этапе колонии обрабатывают немеченой иммунной кроличьей сывороткой, промывают буфером, наносят антикроличью люминесцирующую сыворотку, инкубируют при 37° С 30 минут, сливают конъюгат, трижды промывают буфером и исследуют колонии под люминесцентным микроскопом.
С целью экономии дорогостоящих компонентов реакцию рекомендуется проводить с колониями на агаровых блоках. Отбирают участок агаровой среды с изолированными колониями, вырезают блок размером 5x5 мм, наносят на предметное стекло, фиксируя его смесью парафина (65%) и вазелина (35%). На одном стекле можно помещать 6-10 блоков. Затем на каждый блок наносят каплю фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), удаляют избыток буфера. Наносят на блок каплю немеченой кроличьей сыворотки в рабочем разведении и инкубируют 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Отмывают препарат дважды в буферном растворе по 10 минут. Удаляют буфер с каждого блока и наносят на блоки антикроличью меченую сыворотку в рабочем титре, инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Отмывают препарат двукратно, по
10 минут в буферном растворе, и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Для идентификации колоний на плотных средах рекомендует агаровые блоки помещать на предметное стекло колониями вниз. Затем стекла помещают в водяную баню с температурой 85° С до расплавления агара, при этом колонии фиксируются, затем препарат дополнительно фиксируют 10 минут ацетоном и далее окрашивают по непрямому варианту.
Тест ингибиции роста. Основан на ингибиции роста микоплазм специфической иммунной сывороткой в жидкой или плотной питательной среде (употребляют для идентификации на уровне вида). Требует наличия достаточно активных, моноспецифических, неконсервированных иммунных сывороток. Антисывороткой (0,025 мл), при проведении теста на плотных питательных средах, пропитывают диски фильтровальной бумаги диаметром 6 мм непосредственно перед использованием или хранят их в высушенном состоянии при -20° С. Для тестирования берут чистую культуру концентрацией 10-4 -10-5 КОЕ, которую в объеме 0,2 мл равномерно распределяют по поверхности плотной питательной среды. Чашки выдерживают 1 час при 22-37° С и затем на поверхности агара помещают диски с антисывороткой. Лучшие результаты получают на срезах с субоптимальными концентрациями сыворотки и дрожжевого экстракта. Быстрорастущие микоплазмы дают меньшую зону задержки роста. Зону задержки роста измеряют от края диска. Зону задержки менее 2 мм оценивают как сомнительный результат. При проведении теста ингибиции роста в жидкой или полужидкой среде предварительно готовят двукратные разведения иммунной и контрольной (нормальной) сывороток в объеме 0,2 мл на изотоническом растворе натрия хлорида, добавляют 0,2 мл культуры микоплазм, содержащей 102-103 КОЕ, смесь выдерживают при комнатной температуре, добавляют к ней 1,6 мл питательной среды и инкубируют 72-96 часов. За титр принимают максимальное разведение сыворотки, ингибирующее рост.
Тест ингибиции метаболизма. Может быть проведен на базе любой реакции, отражающей ферментативную активность идентифицируемой микоплазмы. Условием должно быть наличие определенного фермента. В качестве субстратов обычно используют глюкозу (1%), аргинин (0,1%), мочевину (1%), тетразолий хлорид (0,33%) в жидкой питательной среде. В готовой питательной среде готовят двукратные разведения иммунных сывороток и в пробирку с каждым разведением вносят 0,1-0,2 мл исследуемой культуры микоплазм (102-103 КОЕ/мл). Контролем служат засеянные пробирки без антисыворотки. Посевы инкубируют 3-5 суток и путем сравнения опытных и контрольных пробирок делают заключение о специфической ингибиции антителами той или иной метаболической реакции.
Реакция диффузионной преципитации. Используют растворимый антиген, например полученный путем двадцатикратного замораживания и оттаивания суспензии микоплазм. Реакцию ставят обычным способом. Готовят пробойником лунки диаметром 3 мм на расстоянии 5 мм, в центральную лунку вносят антиген, в периферические — сыворотки. Учет результатов проводят через 48 часов. С гомологичной сывороткой антиген дает обычно несколько линий преципитации, с гетерологичными — редко одну, слабо выраженную.
Кроме перечисленных серологических реакций используют для идентификации некоторых видов микоплазм иммуннопероксидазный тест, РСК. В последние годы с успехом апробирована для указанных целей реакция цепной полимеризации. Штаммы M.gallisepticum, а также M.synoviae, M.meleagridis и других птичьих микоплазм имеют внутривидовые вариации антигенных и вирулентных свойств, что может быть выявлено путем электрофореза белков в полиакриаламидном геле, гибридизацией ДНК.