Культивирование. Выделение М.gallisepticum проводят в соответствии с действующей в РФ инструкцией по диагностике респираторного микоплазмоза из материала готовят суспензию 1:10 в МПБ с последующей ее обработкой ингибиторами (ацетат таллия, пенициллин) или фильтрацией через мембранные фильтры № 3,4. Посев производят на одну из питательных сред: Эдварда, Хоттингера, Мартена. Из головного мозга посев проводят без обработки материала ингибиторами. Посев материала, взятого тампонами из трахеи, воздухоносных мешков, а также жидкости из синусов и суставов (0,1 мл) может быть проведен непосредственно в 3-5 мл жидкой питательной среды. При этом оптимальной жидкой питательной средой является среда Фрея, модифицированная для птичьих микоплазм. Для культивирования М.gallisepticum в среду Фрея добавляют свиную или лошадиную сыворотку. Инкубирование посевов проводят при 37° С в аэробных условиях до 14 суток, прежде чем результат исследования признают отрицательным. Посевы просматривают ежедневно на наличие роста, который проявляется легкой опалесцепцией и слабым помутнением среды. На среде Фрея за счет расщепления глюкозы рост возбудителя сопровождается изменением ее цвета до оранжевого или желтого. Рекомендуется проводить до 4-5 слепых пассажей с интервалом между посевами в 5 дней, для чего 1 мл засеянной среды переносят в пробирку с 5-10 мл свежей среды без ингибиторов. Параллельно производят высев на аналогичную агаровую среду. Посев материала может быть произведен первоначально непосредственно на агаровые среды, однако предварительные пассажи на жидкой среде дают лучшие результаты. Засеянные агаровые среды в чашках Петри инкубируют 3-5 дней при 37° С во влажной камере, во избежание подсыхания среды, лучше в атмосфере с 5% СО2. Наличие колоний на плотных средах исследуют при помощи микроскопа (х20-х50) в косо падающем пучке света. Типичные колонии имеют диаметр 0,1-1 мм, темный врастающий в питательную среду центр, прозрачную периферию (форма «яичницы-глазуньи»). В первичных культурах возвышающийся центр может отсутствовать и проявляется у культур 2-3-го пассажа. Одновременно из культур готовят препараты, окрашенные по Романовскому-Гимза. В положительных случаях в препаратах из седимента бульонной культуры или колоний обнаруживают коккоидные образования светло-фиолетового цвета, диаметром около 0,25 мкм.
|
|
Патогенные микоплазмы вырастают на агаровых средах через 4-
5 дней, а непатогенные виды (М.gallisepticum, M.gallinarum, Acholeplasma) уже через сутки инкубирования. Для подавления роста непатогенных микоплазм рекомендуется добавлять в среду соответствующие им иммунные сыворотки. Параллельно проводят дифференциацию обнаруженных колоний от L-форм бактерий.
|
|
Из отобранных колоний культуру отвивают в жидкую питательную среду или агаровым блоком на свежую агаровую среду без ингибиторов. Процедуру повторяют до получения чистой культуры.
Выделение культуры M.sinoviae. Подготовленный материал для выделения этого вида микоплазм высевают на среду Фрея с 10-15% нормальной сыворотки свиньи, инактивированный при 56° С в течение 30 минут, кроме того, в среду добавляют 0,1% восстановленного никотинамида-адениндинуклеотида. Все последующие процедуры по получению чистой культуры возбудителя проводят по вышеописанной схеме.
Выделение культуры M.melagridis. Исследуемый материал для выделения M.melagridis лучше, как и для изоляции M.iowae, высевать на агаровую питательную среду с добавлением лошадиной сыворотки крови. M.melagridis отличается замедленным ростом. Колонии M.melagridis, M.synoviae и М.gallisepticum сходны по морфологии.
Идентификация культур микоплазм. Выделенные культуры микоплазм идентифицируют на основании изучения ферментативных, культуральных особенностей, а также при помощи серологических методов. Исследование чувствительности к дигитонину и уреазной активности позволяет определить родовую принадлежность микоплазм (Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma). Определение способности к ферментации глюкозы, аргинина и образованию фосфатазы дает воз можность отнести изолят к той или иной ферментативной группе. Дальнейшее изучение ферментативных характеристик позволяет установить видовую принадлежность выделенной микоплазмы (табл. 98).
Таблица 98 - Дифференциальные признаки видов микоплазм,