Используется для секвенирования одно- и двухцепочечных фрагментов ДНК.
Этапы метода:
1) специфическая химическая фрагментация изучаемого полинуклеотида
2) фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32Р по 5'- или 3'-концу. У двухцепочечной ДНК метятся обе цепи
3) Подготовка меченных фрагментов к секвенированию. Для этого используются клонирующие векторы, содержащие синтетические полилинкеры. После гидролиза рестриктазами, образующими липкие концы, с помощью фрагмента Кленова избирательно метят клонированные фрагменты по одному концу.
4) Меченные фрагменты делят на порции и каждую подвергают определенной химической модификации. Ее проводят так, чтобы на одну молекулу ДНК в среднем приходилось по одной метке.
Пуриновые основания: диметилсульфат – метилирование аденина по положению N3, гуанина – N7. Обработка 0,1М HCl при температуре 0ºС приводит к отщеплению метиладенина. Инкубация при 90ºС в щелочной среде (0,1М NaOH) вызывает разрыв цепи ДНК в местах отщепления оснований. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК по остаткам метилгуанина.
|
|
Пиримидиновые основания: гидразин. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются тимин и цитозин, а в присутствии 2М NaCl – только цитозин. При обработке пиперидином происходит гидролиз цепи ДНК пр точкам модификации
5) После параллельного проведения четырех различных обработок фрагмента ДНК полученные субфрагменты разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле на соседних дорожках
6) С помощью радиоавтографии геля на рентгеновской пленке считывается нуклеотидная последовательность ДНК
Экспрессия в клетках бактерий рекомбинантных ДНК
Одна из важнейших задач генной инженерии – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных, которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов.