1) гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве.
2) кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки,
3) образующаяся мРНК относительно стабильна и эффективно транслируется.
4) образующийся чужеродный белок не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами.
При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов. Любой полноценный ген состоит из двух основных частей – регуляторной и структурной. Регуляторная часть распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает упорядоченную экспрессию его структурной части. Она высокоспецифична в отношении своих природных эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, факторов сплайсинга и т.д.). Чаще всего регуляторная часть не может функционировать в другом генетическом окружении.
|
|
Генетическая информация передается по схеме ДНК → (транскрипция) РНК → (трансляция) белок. Это необходимые этапы для экспрессии рекДНК.
Экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке является фундаментальным вопросом биологии. Так как генетический код универсален, то возможность такой экспрессии определяется:
Возможность экспрессии эукариотического гена в прокариотической клетке определяется
1) наличием в изучаемом гене сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции
2) правильное узнавание их прокариотической клеткой
Основные отличия систем экспрессии про- и эукариот:
1) большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК–предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности – интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Эукариотические гены, имеющие непрерывную кодирующую последовательность, иногда способны правильно экспрессироваться в клетках бактерий.
2) У прокариот существует одна РНК-полимераза, синтезирующая все типы РНК. У эукариот существуют три типа РНК-полимераз:
РНК-полимераза I (синтезирует рибосомные РНК)
РНК-полимераза II (матричные РНК)
РНК-полимераза III (транспортные РНК)
3) Различия по использованию кодонов, терминирующих трансляцию: в эукариотических мРНК используются все три терминирующих кодона, а в прокариотических – только один.
|
|
4) Различия в последовательностях мРНК, необходимых для инициации трансляции
5) Различные последовательности, ответственные за связывание транскриптов с рибосомальными РНК
Автономная экспрессия клонированного гена возможна только в случае, если инициация и терминация транскрипции происходит полностью на клонируемом фрагменте. В таком случае экспрессия гена не зависит от типа вектора и ориентации в нем встроенного фрагмента ДНК.
При инициации транскрипции на промоторе вектора синтез полноценного белка, детерминируемого клонированной последовательностью, возможен только при наличии в транскрипте участка связывания бактериальной рибосомы.