Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот

1. Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Принцип аналогичен таковому при выполнении ПЦР, но вместо ДНК-полимеразы и dNTP используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95 °С олигонуклеотиды связываются специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50 °С. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов. Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце, а флуоресцеин - на другом конце лигированных

олигонуклеотидов, поэтому они связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Антибиотиновые антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой, также количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и после добавления субстрата дают окрашенный продукт.

2. Каталитическая амплификационная система, или циклическая зондовая технология (ЦЗТ), - противоположность ЛЦР, поскольку принцип состоит не в сшивании двух олигонуклеотидных зондов, а напротив, в расщеплении рибонуклеотидной комплементарной вставки при помощи фермента РНК-азы Н и получении из одного длинного ДНК-РНК-ДНК-зонда двух коротких ДНКовых олигонуклеотидов, которые затем детектируются одним универсальным дезоксинуклеотидным зондом, конъюгированным с маркерным ферментом. Достоинства метода заключаются в изотермальности реакции, исключении возможности перекрестной контаминации, быстроте проведения (менее 1 ч) и в полной автоматизации.