2017-12-14
2352Практическое занятие № 3
Цель занятия. Ознакомиться с потребностями микроорганизмов в питательных веществах и принципами составления питательных сред для выращивания микроорганизмов.
Микроорганизмам, как и всем другим организмам, необходим набор различных химических элементов. Некоторых элементов – C, N, H, P, S, Ca, Mg, K, Fe требуется в относительно больших количествах, и поэтому их относят к макроэлементам, а других – Zn, Mn, CO, MO, B, Cu, J – достаточно наличия следов, поэтому их называют микроэлементами. Кроме того, микроорганизмам нужны некоторые готовые органические соединения, называемые факторами роста.
Микроорганизмы различаются по потребностям в химических элементах и возможностям их использования. Больше всего они отличаются не только от других организмов, но и резко различаются между собой по потребностям в источниках углерода и азота.
По отношению к источникам углерода микроорганизмы делят на две большие группы – автотрофы и гетеротрофы.
Автотрофы (от греч. аutos – сам и trophe – питание) превращают углекислоту CO2, в которой углерод находится в наиболее окисленной форме, в богатые энергией органические соединения собственной клетки (отсюда название автотроф – самопитающийся). Для восстановления СО2 до уровня органических компонентов клетки они используют разные источники энергии. По характеру используемых энергетических источников автотрофы делят на две группы: литотрофы (от гр. lithos – камень, минерал), которые используют энергию окисления минеральных веществ, и фототрофы (от гр. photos – свет), использующие энергию солнечного света.
Гетеротрофы (от гр. heteros – другой) не способны добывать энергию для ассимиляции углерода из СО2 путем окисления минеральных веществ или солнечного света и поэтому нуждаются в готовых органических соединениях, которые они используют и как источник углерода, и как источник энергии (отсюда название гетеротроф – питающийся за счет других, т.е. за счет органических субстратов, синтезированных другими организмами). Среди них есть такие, которые довольствуются всего одним органическим субстратом и самостоятельно строят из него все метаболиты собственной клетки. Есть организмы, нуждающиеся в большом наборе различных углеводов, готовых аминокислот и дополнительных факторов роста в виде сложных органических субстратов.
Большинство гетеротрофных организмов также используют небольшие количества углекислоты, но для них СО2 только дополнительный источник углерода.
Усвоение микроорганизмами различных источников углерода и происходящие при этом энергетические процессы положены в основу классификации их по типам питания (табл.1).
Таблица 1 – Классификация микроорганизмов по типам питания
| Источник углерода | Источник энергии | ||
| Свет | Окисление органических веществ | Окисление неорганич. веществ | |
| Органические вещества | Фотогетеро-трофы | Хемоорганогетеро-трофы | Хемолито- гетеротрофы |
| Неорганические вещества | Фотоавто- трофы | Хемоорганоавто- трофы | Хемолито- автотрофы |
Источником азота для микроорганизмов могут быть различные органические и минеральные соединения. Многие организмы (аммонификаторы) могут использовать органические азотсодержащие вещества (белки, аминокислоты), которые в этом случае являются для них источниками азота и источниками углерода. Поскольку азот входит в состав органических соединений в виде амино- и иминогрупп, т.е. в восстановленной форме, наиболее доступным минеральным источником азота являются аммиачные соли.
Свободный аммиак мало пригоден, так как он создает повышенную щелочность. Менее доступны соли азотной кислоты – нитраты, так как азот нитратов должен быть предварительно восстановлен до аммиака в энергетически зависимой реакции. Соли азотистой - нитриты – для большинства микроорганизмов ядовиты. Они используются только специфическими группами микроорганизмов и в том случае, если их концентрация в среде очень мала.
На восстановление атмосферного азота до уровня аммиака микроорганизмы затрачивают большое количество энергии. Усвоение такого азота доступно микроорганизмам, составляющим группу азотфиксаторов.
Минеральные микроэлементы добавляются в среду для выращивания микроорганизмов в виде катионов неорганических солей. Микроэлементы чаще всего нет необходимости специально вносить в среду, так как большинство микроэлементов являются примесью солей макроэлементов или попадают в среду в составе водопроводной воды.
Для многих микроорганизмов нужны в малых дозах еще органические соединения, называемые факторами роста. Такими веществами являются отдельные аминокислоты, азотистые основания, жирные кислоты и др., а также витамины, которые являются составной частью простетических групп или активных центров различных ферментов.
Исходя из пищевых потребностей микроорганизмов, для их выращивания в лабораторных условиях создают питательные (культуральные) среды, представляющие набор органических и минеральных веществ, обеспечивающих рост и развитие микроорганизмов.
Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологии. Правильный подбор состава среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест их обитания, получения чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность получать биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов.
Требования, предъявляемые к питательным средам:
1. Среды должны содержать все необходимые для микроорганизма питательные вещества и факторы роста в доступной форме и оптимальной концентрации. Недостаток или избыток питательных элементов неблагоприятен для роста микроорганизмов.
Например: для большинства гетеротрофных микроорганизмов применяют среды, содержащие в среднем 0,8-1,2 г/л амминного азота (в составе NH2), 2,5-3.0 г/л общего азота (N), 1 % пептона и 05 % хлоридов в пересчете на NaCl.
2. Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается содержанием 12 % воды, бактериям ее нужно не менее 20 %.
3. Важным фактором является кислотность среды, величина которой различна для разных микроорганизмов. Активная кислотность среды определяется количеством находящихся в ней ионов H+ и обозначается водородным показателем или pH, который представляет собой отрицательный логарифм концентрации водородных ионов. В нейтральной среде, где количество ионов H+ равно количеству ионов OH-, pH=7, в щелочной среде pH больше 7, а в кислотной – меньше 7.
Большинство микроорганизмов развивается при нейтральной или слабощелочной рН. Грибы обычно развиваются в более кислой среде, чем бактерии. Есть среди бактерий кислоустойчивые, например, молочнокислые, уксуснокислые бактерии, ацидофильные – Acetobacter acidophilus или Thiobacillus thiooxidans, который может выдерживать pH меньше 1. При подкислении питательной среды до pH=4 развитие большинства бактерий практически прекращается, в то время как грибы развиваются нормально. К колебаниям pH в пределах от 6 до 9 бактерии мало чувствительны.
После стерилизации pH сред, как правило, изменяется. Чаще всего происходит подщелачивание среды в результате диссоциации (разрушения) карбонатов. Кроме того, в процессе культивирования микроорганизмов могут выделяться в среду метаболиты, изменяющие pH среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или становится невозможным. Так, при сбраживании глюкозы могут накапливаться органические кислоты, и среда резко подкисляется. Усвоение белков и аминокислот приводит к образованию аммиака, что подщелачивает среду.
Чтобы избежать изменения pH, в среду добавляют буферные системы. Используют фосфатные буферы, обладающие максимальной буферной емкостью в физиологически важном диапазоне около нейтрального значения pH. Фосфатные буферы мало токсичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора.
Буферные растворы готовят из двух солей: слабокислой соли – одноосновного фосфата KH2 PO4, которая нейтрализует сильное основание, и слабоосновной соли – двуосновного фосфата K2HPO4, которая нейтрализует образование в среде кислоты.
Иногда в процессе метаболизма микробные клетки образуют кислоту настолько интенсивно, что добавление физиологически возможных количеств фосфатов оказывается недостаточным для сохранения нужного pH, и тогда в среду добавляются карбонаты, которые нейтрализуют избыточные количества ионов водорода, чаще всего мел CaCO3.
Существуют вещества органической природы, входящие в состав питательных сред, которые обладают буферными свойствами. Это аминокислоты и белки. Все эти вещества относятся к амфотерным соединениям и способны соединяться как с кислотами, так и со щелочами, нейтрализуя их.
5. Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, определяющим насыщение ее кислородом и обозначаемым rh2. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh2=41, насыщенный водородом rh2=0. Анаэробные микроорганизмы размножаются при rh2 не выше 5, аэробные – не ниже 10.
6. Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как и внутри клетки. Большинство бактерий довольно устойчиво к этому фактору и может расти на средах, содержащих от 0,1 до 10 % NaCl. Исключение составляют некоторые галофильные микроорганизмы, не способные расти при концентрации соли ниже 1%. К таким организмам относятся многие обитатели соленых водоемов.
7. Среды должны быть стерильными, чтобы обеспечить рост чистых культур микроорганизмов. Режим и способ стерилизации среды определяется ее составом.
Поскольку потребности микроорганизмов чрезвычайно разнообразны, нельзя составить универсальную среду, оптимальную для роста всех микроорганизмов. Существуют самые различные по составу и технике приготовления питательные среды. Применяются естественные и искусственные субстраты, начиная от простой водопроводной воды и солевых растворов до сложных экстрактов из эмбрионов животных, из растений, от отбросов (навоз) до полноценных белков человека и животных.
По происхождению и составу питательные среды делят на натуральные (или естественные), синтетические и полусинтетические.
1. Натуральные среды бывают растительного и животного происхождения. Они содержат в своем составе все ингредиенты, необходимые для роста и развития микроорганизмов. Состав этих сред точно не определен. Такими средами являются отвары злаков, трав, овощные и фруктовые соки, картофель, сыворотка, моча, отвары мяса, навоза, почвы, вода и т.д.
Примером наиболее часто применяемой натуральной среды является мясо-пептонный бульон (МПБ). Для его приготовления сначала готовят мясной отвар. С этой целью свежее мясо (говядину, телятину или конину) освобождают от костей, жира и сухожилий, рубят или пропускают через мясорубку. 500г такого фарша кладут в кастрюлю, заливают 1л водопроводной воды и оставляют в прохладном месте на 24ч или в термостате при 300С на 6ч для экстрагирования различных веществ. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят в течение 30 мин для свертывания белка, который отделяют фильтрованием.
После того как раствор остынет, его фильтруют и стерилизуют. Это основа для приготовления мясо-пептонного бульона. К 1л мясной воды добавляют 10г пептона и 5г NaCl. После 10-15 мин кипячения его остужают, устанавливают необходимое значение pH, фильтруют и стерилизуют. Пептоны добавляют взамен свернувшегося мясного белка. Они являются продуктами неполного разрушения белка, получаемые кислотным или ферментативным гидролизом мяса или молочного казеина. Преимуществом этих источников аминокислот является то, что они легче усваиваются и при стерилизации не свертываются, поэтому стерильный бульон остается прозрачным. МПБ – богатая питательная среда, но в ней мало углеводов.
Дрожжевая среда используется для культивирования многих гетеротрофов. Готовится она из свежих или прессованных дрожжей.
Почвенная вытяжка применяется для выделения и культивирования многих почвенных микроорганизмов. Для этого 1кг почвы заливают 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 30-40 мин. Затем вытяжке дают остыть, сливают надосадочную жидкость и центрифугируют. Проверяют pH фильтрата, разливают в сосуды и стерилизуют при 147 кПа (1,5 атм) 30 мин.
2. Синтетические среды готовят из определенных химически чистых соединений в точно указанных концентрациях. В них можно учесть количество и качество поступающих в клетки веществ, изменение этих соединений под влиянием микроорганизмов, выявить метаболиты, выделяемые микробными клетками в процессе жизнедеятельности. Поэтому на таких средах изучают обмен веществ микроорганизмов. Преимущества синтетических сред заключается также в том, что они точно воспроизводимы. В зависимости от потребностей микроорганизмов синтетические среды могут быть очень сложного состава или довольно простыми.
3. Полусинтетические среды наряду с соединениями известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) содержат натуральные продукты неопределенного состава- мясной отвар, дрожжевой экстракт, пивное сусло. Такие среды часто применяются для выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях и в промышленности.
Среды для одного и того же микроорганизма могут быть различными в зависимости от задач исследования. Например, среды для длительного поддержания культур микроорганизмов могут сильно отличаться от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена, когда требуется стимулировать отдельные стороны жизнедеятельности микроорганизмов.
По назначению среды делят на:
1. Общеупотребительные или среды общего назначения.
На таких средах выращиваются и накапливают биомассу многие микроорганизмы. Это МПА, МПБ и др.
2. Специальные среды или среды специального назначения. Эти среды предназначены для выявления тех или иных биохимических особенностей микроорганизмов или для получения культур микроорганизмов, обладающих особыми свойствами. Среди специальных сред различают элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.
Элективные среды (от лат. electus – избираю) обеспечивают наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. В них могут быть добавлены вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. При посеве на них материала содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет избирательна. Такие среды применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К ним относится среда Эшби для азотофиксирующих бактерий, в составе которой отсутствует источник азота, среды с сывороткой или кровью для патогенных микроорганизмов, среды специального минерального состава для различных групп автотрофных микроорганизмов и др.
Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. Состав этих сред позволяет четко выявить наиболее характерные свойства изучаемого микроорганизма. Это среды с молоком, кровью, желатином, на которых выявляются протеолитические и гемолитические свойства микроорганизмов. Наличие желатиназы и других протеолитических ферментов определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят такие индикаторы, как нейтральный красный, феноловый красный, метиленовый синий и др. Изменяя окраску при различных значениях pH, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата.
Например: среда Эндо - применяется для выделения и определения бактерий кишечной группы. В ее состав входит лактоза, насыщенный спиртовой раствор фуксина, обесцвеченный перед добавлением в среду 10 %-м водным раствором сульфита натрия (образуется бесцветная фуксин-сернистая кислота). Кишечная палочка при росте на такой среде ферментирует лактозу с образованием альдегидов, вследствие этого бесцветная фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид сернистое соединение с образованием фуксина, который окрашивает колонии кишечной палочки в красный с металлическим блеском цвет. Таким образом, на среде Эндо легко отделить кишечную палочку от других представителей микрофлоры кишечника.
Среды различаются по консистенции. В зависимости от задач используются жидкие, сыпучие и плотные среды.
Жидкие среды применяют для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов, для хранения культур. На жидких средах легче выявляются физиолого-биохимические особенности микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют в основном в промышленной микробиологии. Это разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором.
Плотные среды необходимы для выделения и описания культуральных свойств чистых культур микроорганизмов, так как на них можно получить изолированный рост отдельных клеток (колонии), для хранения культур, определения их свойств, например, антагонистических отношений между микроорганизмами и др.
Лучшим гелеобразующим веществом является агар-агар (по малайски - желе), получаемый из водорослей. Это сложный полисахарид, который образует гель с точкой плавления 96-1000С и температурой застывания около 400С. Кроме того, агар-агар используется лишь немногими микроорганизмами в качестве питательного субстрата.
Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1-2 % агар-агара. Таким образом, из МПБ готовят МПА. Для получения более плотной среды вносят 3 % агара. Полужидкие среды получают, добавляя 0,3% агара, их используют для определения подвижности микроорганизмов. Агаризированные среды сохраняют свои свойства после неоднократного плавления и стерилизации.
Если требуется получить плотные среды, не содержащие органических компонентов, применяют в качестве уплотнителя силикагель (кремнекислый гель).
Желатин – это вещество белковой природы, которое получается из костей и хрящей животных при их вываривании. Желатин добавляют к средам в количестве 10-20%. Желатин как уплотнитель применяется ограниченно. Это связано с тем, что он разжижается под действием протеолитических ферментов, выделяемых многими микроорганизмами. Кроме того, образуемый желатином гель плавится при 23-250С и застывает при 200С, а большинство микроорганизмов развивается при 30-370С, т.е. температуре, при которой желатин находится в расплавленном состоянии. Поэтому желатин используют главным образом для выявления протеолитической активности микроорганизмов.
Многие среды в настоящее время изготавливаются промышленным способом в виде сухих порошков. Преимущество таких сред в их стандартности, стабильности, простоте приготовления и транспортировки. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи, указанной на этикетке.
Питательные среды сразу же после их приготовления подвергают стерилизации. Режим и способ стерилизации определяется составом сред и их консистенцией. Обычно среды стерилизуют в автоклаве в небольших сосудах. Агаризированные среды стерилизуют при давлении 98 кПа (1 атм.) – 20 мин. Жидкие питательные среды можно стерилизовать фильтрованием.
Если в составе среды имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью (например, почва), то такие среды обычно стерилизуют при 147-196 кПа (1,5-2 атм) 2 ч.
Подготовленные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при 370С на 1 сутки или делают посев на тиогликолевую среду. Сохраняются питательные среды в прохладном, сухом, темном месте.
Задание: 1. Прочитать теорию вопроса, составить конспект.
2. Приготовить 100мл питательной среды (МПА или РПА (рыбо-пептонный агар). Подготовить флакон со средой к стерилизации, закрыть ватно-марлевой пробкой, надеть бумажный колпачок и написать название питательной среды и дату ее приготовления.
Материалы и оборудование: сухой рыбо-пептонный агар, флаконы объемом 100мл, весы, автоклав, стеклянные палочки, ватно-марлевые пробки, бумага для колпачков, бечевка, ножницы, пинцеты.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы: 1. Каковы особенности питания микроорганизмов? 2. Каковы потребности микроорганизмов в источниках питания? 3. Какие требования предъявляют к питательным средам? 4. Как классифицируют питательные среды? 5. Какие существуют способы уплотнения сред? 6. Как стерилизуют и хранят среды?
