Каллусогенез как основа создания клеточных культур

Практически важные технологии in vitro разработаны с использованием объектов разной сложности организации, начиная с изолированных протопластов и кончая изолированными органами или зародышами. Однако культивируемые клетки играют при этом центральную роль. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная.

Каллусной тканью, или каллусом называют ткань, возникшую путем неорганизованной пролиферации клеток растений. В свою очередь, пролиферация это новообразование клеток и тканей путем размножения.

Для получения каллуса фрагменты тканей разных органов растений, называемые эксплантами, помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы или чашки Петри. Процесс получения и культивирования каллуса требует абсолютной асептики. Экспланты обрабатывают различными стерилизующими растворами, содержащими чаще всего активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты. Питательные среды и посуду перед использованием стерилизуют горячим паром в автоклавах. Соединения, разрушающиеся при высокой температуре, стерилизуют путем фильтрации через специальные фильтры, размер пор которых не превышает 0,2 мкм.

В состав питательных сред в виде солей входят основные элементы, необходимые для поддержания жизни растений: калий, кальций, азот, магний, фосфор, сера, а также микроэлементы: железо, цинк, бор, медь, марганец, кобальт и другие. Культивируемые клетки не способны к фотосинтезу, поэтому в состав питательных сред в качестве источника энергии включен сахар, чаще всего сахароза или глюкоза. Каллусные клетки нуждаются также в витаминах. Потребность в органическом азоте удовлетворяется за счет введения в состав среды гидролизата казеина или отдельных аминокислот. Очень важным компонентом питательных сред являются природные фитогормоны (ИУК, ИМК, зеатин) или синтетические регуляторы роста с гормональной активностью: ауксиновой – нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или цитокининовой - бензиламинопурин (БАП), кинетин и др. Разработано несколько вариантов стандартных питательных сред.

Ткань, образующаяся на питательной среде из клеток экспланта, называется первичным каллусом. Для поддержания его роста по мере истощения элементов питания часть каллуса периодически переносят на свежую питательную среду. Время между пересадками (субкультивированиями) варьирует в зависимости от скорости роста тканей от 3 до 6 недель. Каллус, постоянно поддерживаемый в культуре in vitro, называется пассируемым.

Культивирование каллуса на твердой питательной среде называется поверхностным. Помимо поверхностной культуры можно получить суспензионную культуру клеток, выращиваемую в жидкой питательной среде. Состав жидкой среды, как правило, такой же, как и твердой, но без агара. Для получения суспензионной культуры больше подходят рыхлые каллусы, распадающиеся в жидкой среде на отдельные клетки и группы из 5-50 клеток – агрегаты. Суспензионные культуры выращивают в колбах при обязательном перемешивании на качалках, чтобы обеспечить нормальное снабжение клеток кислородом. Периодически часть суспензии переносят в свежую питательную среду для поддержания непрерывного роста. Клетки в жидкой питательной среде размножаются обычно быстрее, чем на твердой, поэтому промежуток времени между пересадками сокращается до 2-3 недель.

Состояние культивируемых тканей оценивают по доле живых клеток, скорости роста и активности клеточных делений. Жизнеспособность клеток определяют под микроскопом с использованием специальных красителей, например, синей Эванса или метиленовой синей, феносафранина, эозина и др. Краситель не проникает в живые клетки, сохранившие целостность плазматической мембраны, поэтому окрашиваются только мертвые клетки.

Рост культур оценивают по увеличению сырой или сухой массы ткани в цикле выращивания или по увеличению числа клеток в 1 мл. Последний показатель чаще используют для суспензионных культур. Рост тканей складывается из деления и растяжения клеток. Для характеристики активности деления используют показатель называемый митотическим индексом. Это доля клеток, находящихся в данный момент времени в фазе митоза. Определяют митотический индекс под микроскопом на давленых препаратах или срезах тканей, окрашенных ацетоорсеином или ацетокармином, как процент делящихся от общего числа клеток.

Рост ткани в культуре in vitro описывается S-образной кривой. Весь цикл роста принято разделять на несколько фаз: латентная (лаг-фаза), где видимый рост не наблюдается; экспоненциальная, где рост идет с ускорением; линейная, где скорость роста постоянна; фаза замедления роста, стационарная фаза, во время которой масса ткани и число клеток не меняются и фаза деградации, сопровождающаяся гибелью клеток. В зависимости от вида растения, используемого экспланта, состава питательной среды или условий выращивания соотношение продолжительности отдельных фаз ростового цикла может изменяться.

Клетки растений, выращенные вне организма, обладают уникальной способностью не только делиться, образуя неорганизованно растущую массу, но и переходить к вторичной дифференцировке, давая начало элементам сосудистой системы, зачаткам органов или зародышеподобным структурам, которые в дальнейшем развиваются в целое растение. Свойство изолированных клеток полностью реализовать свой потенциал развития с образованием нового организма называется тотипотентностью. Совокупность процессов дифференцировки клеток с образованием специализированных органов и тканей объединяется понятием морфогенез в культуре in vitro.

Основным фактором, вызывающим переход неорганизованно размножающейся клетки к морфогенезу, является изменение набора или количества гормональных факторов в питательной среде. Наряду с гормонами на индукцию морфогенеза влияют сахара, отдельные аминокислоты и другие трофические вещества. Имеют значение также интенсивность и качество освещения, температура, аэрация и другие физические факторы.

Различают несколько видов морфогенеза: гистогенез, органогенез и соматический эмбриогенез. Гистогенез, или гистологическая дифференциация каллусных клеток, это образование в каллусе различных тканей: элементов сосудистой системы, млечников, волокон, трихом. Органогенез – это дифференциация каллусных клеток в целые органы. В зависимости от типа образующихся органов различают гиногенез – образование стеблевых апексов, ризогенез – закладку зачатков корней и флоральный морфогенез – формирование цветковой меристемы. Соматический эмбриогенез – это образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов – зародышеподобных структур, способных развиваться во взрослое растение.