Приготовление красок, питательных сред, описание методов

Приготовление агаровых питательных сред кровяного, шоколадного, полужидкого агара, "обогащения" ликвора (см. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г.)

10.1. Сывороточный агар.

В качестве основы используют 1,2-1,5% агар /рН=7,4/, приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульоне из перевара Хоттингера/аминный азот в бульоне 150-180 мг/мл/ или на сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50°С агара добавляют 20 мл инактивированной при температуре 56°С в течение 30 минут сыворотки, консервированной хлороформом, или без консерванта (при инактивировании сыворотки консервант улетучивается). После перемешивания среду разливают в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике, должны быть подсушены и подогреты до температуры 37°С.

10.2. Сывороточный агар с ристомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара (такого же, как и для приготовления сывороточного агара) добавляют 20 мл сыворотки и 0,1 мл. раствора ристомицина, содержащего 20.000 ед/мл (конечная концентрация антибиотиков 20 ед/мл питательной среды).

В связи с испытываемыми трудностями в снабжении ристомицином рекомендуется простой метод, позволяющий экономно расходовать антибиотик. Препарат разводят стерильным физиологическим раствором до рабочей концентрации и затем разливают по стерильным пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам под ватными или резиновыми пробками и замораживают в морозильной камере. Количество рабочего раствора во флаконах или пробирках зависит от потребности лаборатории.

Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента использования. В случае необходимости раствор оттаивают и добавляют в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг (100 000 ед.) ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического раствора. Полученное разведение препарата является рабочим. Его удобно разлить по 0,5 мл и заморозить В таком состоянии препарат может храниться несколько месяцев.

10.3. Сывороточный агар с линкомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл.

Конечная концентрация антибиотика в среде - 5 мкг/мл питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при температуре +4°С в течение 6 месяцев.

10.4. Желчно-сывороточный агар.

5,0 мл сухой бычьей желчи*(11) растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят рН до 7,2-7,4, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд. К 80 мл расплавленного и охлажденного до 50°С питательного агара добавляют 4,0 мл стерильного раствора желчи, перемешивают, затем добавляют 20,0 мл сыворотки животных, снова хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Конечная концентрация желчи в среде - 0,2%. Посев испытуемых культур нейссерий производят штрихами на сектора чашки.

10.5. Плотные среды с углеводами.

Готовят на той же питательной основе, что и предыдущие. К 75 мл агаровой основы добавляют 0,9 г одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3,9 мл раствора индикатора фенолового красного. Агар стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут или однократно в течение 30 минут при 0,5 атм.

Перед употреблением среду растапливают в водяной бане, охлаждают до температуры 48-50°, добавляют 20 мл инактивированной нормальной сыворотки и разливают в чашки. На 1 чашку можно посеять не более 6 культур. Сектор с посевом должен быть узким, у основания не более 1 см, а расстояние между ними не менее 2-3 см.

Таким образом, каждую культуру засевают на 1/4- 1/8 пяти чашек с различными углеводами. Учет результатов производят через 24 часа инкубации в термостате. При разложении какого-либо углевода с образованием кислоты красный цвет среды в секторе посева меняется на ярко-желтый.

Приготовление раствора индикатора фенолового красного (фенол-рот).

Смешивают 0,4 г порошка фенол-рот с 16 мл 0,1 N NaOH и выдерживают в термостате до полного растворения при частом встряхивании. Затем раствор доводят до объема 200 мл дистиллированной водой, разливают во флаконы и стерилизуют при 1 атм. в течение 20 минут.

10.6. Транспортные среды для выделения менингококков из носоглоточной

Слизи.

10.6.1.Бульон для приготовления смоченных тампонов.

Бульон готовят на любой питательной основе с добавлением 20% сыворотки животных и ристомицина из расчета 20 ед/мл Среды. Используют ватные тампоны на алюминиевых стержнях, вмонтированные в пробирку (п.6.6.). Перед выездом за материалом тампоны пропитывают бульоном из расчета 10-12 тампонов в 5 мл бульона, соблюдая стерильность. Тампоны к месту взятия материала и обратно в лабораторию доставляют, предохраняя их от холода. Длительность транспортировки материала с момента взятия до посева в питательную среду не должна превышать 3-х часов.

10.6.2.Приготовление жидких транспортных сред с линкомицином.

Используют любой питательный бульон или 2% пептонную воду, рН=7,2-7,6. К 100 мл стерильного бульона добавляют 0,5 мл линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл. Конечная концентрация линкомицина - 5 мкг/мл. Среда сохраняется в холодильнике не более 2-х суток. Непосредственно перед взятием носоглоточной слизи (можно в помещении, где находятся обследуемые лица) среда без огня разливается по 1,0 мл в стерильные пробирки. Перед погружением тампона пробку извлекают, тампон вставляют в пробирку так, чтобы материал был погружен в среду; пробирку со вставленным тампоном снова закрывают. Пробирки транспортируют в вертикальном положении при температуре не ниже 22°С. По доставке в лабораторию тампоны отжимают о стенки пробирки и производят посев на сывороточный агар без антибиотиков в чашки Петри. На одной чашке можно разместить 2 посева. Транспортные среды с линкомицином применяют при необходимости транспортировки материала в течение более 3-х часов.

10.6.3. Приготовление полужидкой среды обогащения для носоглоточной слизи.

К 80 мл полужидкого питательного агара добавляют 20 мл любой сыворотки и 0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 20 000 ед/мл (конечная концентрация 20 ед/мл питательной среды). Среду разливают в пробирки по 3 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля и затем хранят в холодильнике.

10.7."Двухфазная " питательная среда.

Питательная среда содержит не только х, гамма факторы, необходимые для роста Н.influenzae, но витамины, что способствует росту других микроорганизмов, в том числе менингококков и пневмококков.

В этой связи среда может быть использована только для посева "стерильного" материала, взятого из закрытых полостей (СМЖ, кровь, эксудат и т.п.) со всеми предосторожностями от возможного загрязнения.

В основу двухфазной среды взята питательная среда "шоколадный агар" на триптическом переваре (Хоттингера, триптикоза - соевый и др.). При добавлении крови животного среда прогревается в течение 10 мин. при 65-80°С двукратно, употребление крови человека требует прогревания среды в течение 15 мин. при температуре 100°С (что разрушает анти-Y фактор в этой крови). Среда разливается в пробирки по 5,0 мл или флаконы по 50,0 мл и скашивается.

После затвердения "косяков" в пробирки добавляют по 3,0 - 5,0 мл, а во флаконы по 50,0 мл бульона на переваре "Хоттингера", к которому добавляется гретая кровь и экстракт пекарских дрожжей*(12).

Среда для употребления хранится в холодильнике, перед внесением в нее патологического материала согревается в термостате. Засеянные у постели больного пробирки тотчас доставляются в лабораторию. При невозможности осуществить доставку немедленно они помещаются в термостат с последующей передачей в лабораторию. В лаборатории из "двухфазной" среды делают посев на чашки с агаром. Уже через 3-4 часа жидкая часть среды мутнеет от роста в ней культуры, из которой можно сделать мазок для микроскопирования.

11. Методы серологической идентификации менингококков
или их антигенов

11.1 Реакция агглютинации на стекле (см. Инструкцию по применению сывороток).

11.2 Реакция агглютинации в полистироловых пластинах.

При постановке реакции агглютинации (РА) используют полистироловые пластины или большие стекла. Для каждой испытуемой культуры менингококков используют один ряд лунок пластины. Число горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки плюс 1 капля взвеси культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых культур. Для этого запаянной изогнутой пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают с чашки Петри и тщательно эмульгируют в физиологическом растворе. Для получения оптимальной рабочей густоты к взвеси добавляют по 1,0 мл физиологического раствора. Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки. Пластины встряхивают в течение 1 мин. руками или шуттеле-аппарате.

Учитывают реакцию в течение первых 3-х мин. Контролем служит лунка, в которой готовят исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.

11.3 Реакция преципитации для определения серогруппы менингококков и