Визначення концентрації білків біуретовим методом

Матеріали реактиви обладнання:

Розчини білків з невідомою концентрацією, стандартний розчин альбуміну (10 мг/мл), біуретовий реактив, штатив з пробірками, піпетки, міліметровий папір, фотометр КФК-3.

Приготування біуретового реактиву. В 50 мл дистильованої води розчиняють 0,15 г СuSO₄·5H₂O і 0,6 г NaKC₄H₄O₆·4H₂O (виннокислий натрій-калій або сегнетова сіль). До одержаного розчину при енергійному перемішуванні доливають 30 мл 10%-ного розчину NaOH (звільненого від Na₂CO₃) і додають 0,1 г KJ. Об’єм розчину доводять до 100 мл і зберігають в щільно закритому посуді.

Хід роботи

До 1 мл розчину, що містить білок (2-10 мг/мл), додають 4 мл біуретового реактиву. Проби перемішують і залишають при кімнатній температурі. Через 30 хв визначають оптичну густину в пробах на фотометрі КФК-3 при 540 нм. Колориметрують проти контролю, для приготування якого до 1 мл дистильованої води додають 4 мл біуретового реактиву. Концентрацію білка визначають по калібрувальному графіку. Для побудови калібрувального графіку готують розчини білка з відомою концентрацією, як показано нижче:

З кожного розчину відбирають по 1 мл, додають 4 мл біуретового реактиву і колориметрують проти контролю при 540 нм.

Контрольні запитання.

1. В чому полягає визначення білка за методом К’єльдаля?
2. Які амінокислоти мають максимум поглинання при 280 нм? Як використовується ця особливість в лабораторній практиці?
3. На яких реакціях базується кількісне визначення білків біуретовим методом і методом Лоурі?
4. Дайте порівняльну характеристику різних методів визначення концентрації білків?
5. Опишіть порядок визначення кількості білків методом Лоурі та біуретовим методом.