Зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества в растворе более сложная, чем между поглощением света и концентрацией. Это связано с тем, что процесс излучения является вторичным и зависит от предшествующего ему процесса поглощения света.
Рассмотрим простейший случай, когда в растворе находится только одно флуоресцирующее вещество.
Таким образом:
Следовательно, зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества не является линейной.
Функцию можно разложить в ряд Маклорена
Если произведение (оптическая плотность раствора) невелико, то и тогда
Таким образом, при малых значениях оптической плотности (при lвозб) зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации можно считать линейной, что и используется в количественном анализе. При более высоких значениях A зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации становится более сложной и отклоняется от линейной. При A = 0,01 отклонение от линейности составляет 1%, 0,05 - 5%; 0,5 - около 35% (рис. 21.4).
Рис. 21.4. Зависимость между интенсивностью флуоресценции и оптической плотностью раствора
1) рассчитанная по упрощённой формуле I = KC; 2) реальная
Влияние оптической плотности раствора на интенсивность флуоресценции называется «эффектом внутреннего фильтра». Этот эффект обусловлен двумя причинами:
· поглощением возбуждающего света, вследствие чего частицы, находящиеся дальше от источника излучения, будут получать меньше возбуждающего излучения;
· поглощением одними частицами вещества излучения, испускаемого другими частицами этого же вещества.