Методы количественного определения белков

Для определения количества белка в образце используется ряд методик:

1)Биуретовый метод

2)Микробиуретовый метод

3)Метод Бредфорда

4)Метод Лоури

Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Разработан в 1949 году Горналлом, Бардавиллом и Дэвидом, ныне мало используется в биохимической лабораторной практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за низкой чувствительности.Содержание

Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540—560 нм.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Чувствительность метода — 2-10 мг/мл.

Микробиуретовый метод — основан на взаимодействии пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. В результате реакции образуется комплекс, окрашенный в фиолетовый цвет.

К 0,2 мл раствора белка добавляют 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Смесь инкубируют 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрируют на длине волны 330 нм. Построение калибровочного графика проводят по стандартному раствору белка.

Метод Лоури — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Лоури (Lowry) в 1951 году.[1] Является самой цитируемой научной статьей в мире (к январю 2004 году статья была процитирована более 275000 раз).В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку — 10 — 100 мкг/мл.

Метод Бредфорда — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Мерион Бредфордом (англ. en:Marion M. Bradford) в 1976 году.[1] Статья М. Бредфорд в журнале Anal Biochem, посвящённая методу количественного определения белка в растворе, является одной из самых цитируемых научных статей в мире.

Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.[2]

Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее «капризный» по сравнению с методом Лоури.