Результаты исследования и их обсуждение

Важное значение при разработке методики хроматографического исследования имеет выбор элюентов и условий хроматографирования. При выборе элюентов учитывали характер анализируемых соединений и их способность растворяться в амфифильных растворителях.

Было исследовано влияние подвижных фаз различного состава на селективность методики. Выбор состава подвижных фаз был основан на кислотно-основных свойствах метронидазола. Метронидазол является амфолитом, так как содержит в молекуле одновременно кислотный и основный центр [11].

Нормативные документы на лекарственные формы метронидазола рекомендуют использовать в качестве компонента подвижной фазы метанол, обладающий высоким токсичным эффектом и требующий специальных условий хранения. Для оптимизации методик нами был проведен опыт с применением более безопасного и доступного растворителя – ацетонитрила[12,13].

Ацетонитрил широко применяется в анализе фармацевтических препаратов, а также обладает высокой элюирующей силой, низкой вязкостью, доступностью, сравнительно низким токсическим действием. Вторым элюентом был выбран раствор дигидрофосфата калия, который является наиболее распространенным элюентом в ВЭЖХ-анализе, т.к. позволяет задать необходимое значение рН [19-21].

В ходе эксперимента было установлено, что при использовании смеси раствор 0,1 М дигидрофосфата калия рН 6,4 и ацетонитрила (85:15) время удерживания метронидазола составляет 5,7 минут. Данный показатель времени удерживания был получен в результате экспериментов путем изменения соотношения объема растворителей, при определении специфичности методики.

Ва­лида­ция ме­тоди­ки. Ва­лида­цию ме­тоди­ки оп­ре­деле­ния метронидазола про­води­ли на ос­но­вании ру­ководс­тва по ва­лида­ции би­оана­лити­чес­ких ме­тодик FDA и EMA, а так­же «Ру­ководс­тва по эк­спер­ти­зе ле­карс­твен­ных средств» [18].

Согласно современным рекомендациям ICH и ведущих фармакопей методика количественного определения должна быть валидирована по основным характеристикам, таким как специфичность (specificity), линейность (linearity), правильность, или истинность (accuracy, or trueness), прецизионность (precision).

Специфичность методики. При подборе условий разделения метронидазола в присутствии компонентов ЛП и примесей удалось достичь полного разделения. На хроматограмме пики определяемых веществ хорошо разделены между собой, пики примесей из растворителя, компоненты подвижной фазы и основы лекарственной формы не мешают их определению.

Для оп­ре­деле­ния спе­цифич­ности про­води­ли ана­лиз 5 об­разцов стан­дар­тно­го рас­тво­ра метронидазола в ди­апа­зоне кон­цен­тра­ций 56,0-84,0 мкг/мл. На хро­матог­раммах стандартных об­разцов не наб­лю­далось пи­ков со вре­менем удер­жи­вания, со­от­ветс­тву­ющим вре­мени удер­жи­вания метронидазола. Со­от­ветс­тву­ющие хро­матог­раммы при­веде­ны на ри­сун­ках 1 и 2.

Ри­сунок 1 -Хро­матог­рамма стандартного раствора метронидазола

(конц. 56 мкг/мл)

Ри­сунок 2 - Хро­матог­рамма стандартного раствора метронидазола

(конц. 84 мкг/мл)

Ли­ней­ность. Про­води­ли ана­лиз 7 стандартных растворов следующих концентраций: 56 мкг/мл, 59,5 мкг/мл, 63 мкг/ мл, 70 мкг/мл, 77 мкг/мл, 80,5 мкг/мл, 84 мкг/мл. По по­лучен­ным зна­чени­ям пос­тро­ены ка­либ­ро­воч­ные гра­фик (r² = 0.99952), при­веден­ный на рис. 3 сов­мес­тно с урав­не­ни­ем ка­либ­ро­воч­ной кри­вой.

Ри­сунок 3 - Ка­либ­ро­воч­ный гра­фик за­виси­мос­ти пло­щади пи­ка метронидазола от его кон­цен­тра­ций.

От­кло­нения кон­цен­тра­ций ка­либ­ро­воч­ных рас­тво­ров, рас­счи­тан­ных по урав­не­нию ли­ней­ной за­виси­мос­ти от фак­ти­чес­ких зна­чений при­веде­ны в таб­ли­цах 2, 3.

Таблица 2 -Калибровочная последовательность №1

Код пробы	std (mkg/ml) 56	std (mkg/ml) 59,5	std (mkg/ml) 64	std (mkg/ml) 70	std (mkg/ml) 77	std (mkg/ml) 80,5	std (mkg/ml) 84
C факт, мкг/мл		59,5				80,5
С рассчит, мкг/мл	56,81	59,2	64,07	70,43	76,56	79,01	84,31
ε, %	1,5	0,5	0,1	0,6	0,6	1,8	0,4
Норма	Не более 2,00%

Таблица 3 - Калибровочная последовательность №2

Код пробы	std (mkg/ml) 56	std (mkg/ml) 59,5	std (mkg/ml) 64	std (mkg/ml) 70	std (mkg/ml) 77	std (mkg/ml) 80,5	std (mkg/ml) 84
C факт, мкг/мл		59,5				80,5
С рассчит, мкг/мл	56,93	59,08	64,08	70,5	76,52	78,96	84,34
ε, %	1,7	0,7	0,1	0,7	0,6	1,9	0,4
Норма	Не более 2,00%

По­лучен­ные от­кло­нения со­от­ветс­тву­ют нор­мам FDA и EMA (не бо­лее 2% для всего ди­апа­зона ли­ней­нос­ти).

Пра­виль­ность и пре­цизи­он­ность. Про­води­ли ана­лиз 3 об­разцов с при­бав­ле­ни­ем стан­дар­тно­го рас­тво­ра метронидазола до по­луче­ния кон­цен­тра­ций: 56 мкг/мл, 70 мкг/мл, 84 мкг/мл. Каж­дый рас­твор хро­матог­ра­фиро­вали 5 ра­з. Ис­сле­дова­ние про­води­ли в те­чение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter - day). Для по­лучен­ных зна­чений кон­цен­тра­ций бы­ли рас­счи­таны ве­личи­ны от­но­ситель­но­го стан­дар­тно­го от­кло­нения (RSD, %) и от­но­ситель­ной пог­решнос­ти (ε,%), при­веден­ные в таб­ли­цах 4 и 5.

Таб­ли­ца 4 - Правильность и прецизионность (сходимость) методики (intrer- run). Последовательность №1

Введено (мкг/мл)	Найдено (мкг/мл)	Найдено (мкг/мл), среднее значение (n=6)	S.D. (n=6)	RSD, % (n=6)	ε, %
	56,48	56,57	0,158	0,280	1,018
56,88
56,53
56,57
56,52
56,44
	70,55	70,46	0,119	0,170	0,662
70,63
70,4
70,5
70,3
70,4
	84,87	85,09	0,109	0,129	1,300
85,14
85,12
85,15
85,12
85,15

Таблица 5 - Правильность и прецизионность методики (inter-run). Последовательность № 2

Введено (мкг/мл)	Найдено (мкг/мл)	Найдено (мкг/мл), среднее значение (n=12)	S.D. (n=12)	RSD, % (n=12)	ε, % (n=12)
	56,66	56,607	0.117	0.207	1.083
56,62
56,66
56,71
56,58
56,63
	70,53	70,486	0,106	0,150	0,694
70,34
70,52
70,59
70,47
70,6
	85,12	85,198	0,150	0,177	1,426
85,33
85,32
85,37
85,26
85,42

Полученные величины относительного стандартного отклонения (прецизионность) и относительной погрешности (правильность) соответствуют нормам (не более 2,00 %).

Ста­биль­ность. Ста­биль­ность бы­ла под­твержде­на для стан­дар­тных рас­тво­ров метронидазола (при хра­нении рас­тво­ра в те­чение 14 дней при тем­пе­рату­ре от 2 до 8 ^оС), крат­ковре­мен­ная ста­биль­ность (для при­готов­ленных проб в те­чение 24 ч при ана­лизе на сле­ду­ющий день) - на уров­нях кон­цен­тра­ции 56 мкг/мл 56 нг/мл и 84 мкг/мл концентрации. Пло­щадь пи­ка при пов­торных ана­лизах не ме­нялась бо­лее, чем на 10%.

Выводы. Разработана унифицированная методика хроматогра-фического анализа метронидазола в субстанции и лекарственных препаратах. Результаты валидации позволяют использовать разработанную методику в фармацевтической практике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Падейская Е.Н. Метронидазол – антимикробный препарат для лечения бактериальных и протозойных инфекций// РМж.-2010. - С 909-914

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 16-ое издание.-2012 г., т. II.-С.-322-324

3. Справочник Видаль 2013 г. Лекарственные препараты в России. Vidal 2013.-С.276-278

4. Белоусов Ю.Б., Шатунов С.М. Антибактериальная химиотерапия. / Ремедиум 2001.

5. Теплых А.Н., Илларионова Е.А. Количественное определение метронидазола спектрофотометрическим методом // Сибирский медицинский журнал.- 2009 № 5.-С.48-50

6. ГФ Республики Казахстан.- том II.- 2009.-С.541-544

7. ГФ Российской Федерации XII.- часть I –2007.-С. 346-347

8. U.S. Pharmacoрoiea. - 30,32 NF.- 2007.- Р. 377-380

9. British Pharmacoрoeiа.-V.- I.- 2009.-Р.301-303

10. Барам Г.И., Рейхарт Д.В.,.Гольдберг Е.Д,.Изотов Б.Н, Родинко М.О., Хазанов В.А. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2003.- т.135, №1, с.75-79

11. Беликов B.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч: Учебн. пособие - М.: МЕД пресс-информ,- 2008.-С. 429.

12. Лазарев Н. В., Левина Э. Н. Вредные вещества в промышленности // Справочник для химиков, инженеров и врачей. Изд. 7-е, пер. и доп. В трех томах. Том I. Органические вещества.2008.-С.-176-177

13. Armarego W. F., Chai C. L. L Purification of Laboratory Chemicals. — 6th Ed. — Elsevier, 2009. — С. 91—92. — ISBN 978-1-85617-567-8.

14. URL: http://cyberleninka.ru/article/n/razrabotka-detskoy-lekarstvennoy-formy-na-osnove-mikrokapsul-s-metronidazolom.

15. Mikrobiyol Bul, The First Metronidazole-Resistant Bacteroides Species Isolated at Marmara University Hospital: Bacteroides the taiotaomicron. - 2013 Oct.-Р.717-21

16. Metronidazole increases the emergence of ciprofloxacin- and amikacin-resistant Pseudomonas aeruginosa by inducing the SOS response/Journal of Antimicrobial Chemotherapy Volume 68 Issue 12 December 2013.-Р.72-75

17. Эпштейн Н. А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. -Т. 38. - № 4. - С. 40-55.