Возможно, из тверских земель происходил руководитель крупнейшего в России бунта периода «смутного времени» Иван Болотников. В конце 1606 г. к восставшим присоединились ржевские, зубцовские и старицкие крестьяне.
В том же году здесь появились польские отряды, поддерживавшие Лжедмитрия I. Диомид Карманов писал о захвате в начале 1606 г. нескольких тверских городов. Поляки разорили Борисоглебский монастырь в Торжке, в результате предательства части бояр захватили Тверь, грабили сельскую округу.
Осенью тверитяне сумели отразить попытку поляков вновь захватить город. В грамоте патриарха Гермогена от 30 ноября 1606 г. описано это событие. Архиепископ Тверской и Кашинский Феоктист возглавил сопротивление осаде: «...и тех злых врагов и грабителей и разорителей под градом Тверью... побили и живых многих разбойников и еретиков поимав к Москве прислали». Успешная оборона Твери заставила горожан, прежде выступавших за Болотникова, отказаться от поддержки бунтовщиков. Отряд тверитян двинулся на помощь царю Василию Шуйскому.
Смута облегчала доступ иноземному вмешательству. Летом 1607 г. появился новый самозванец, Лжедмитрий II, поддержанный поляками. На следующий год его войска стали лагерем в с. Тушино, между Смоленской и Тверской дорогами. Польские отряды начали нападать на города и сёла центральных и северных районов страны. Таким образом, тверская округа, прикрывавшая Москву с запада, оказалась в гуще событий.
Тверь и расположенные западнее Ржев, Осташков и Торопец являлись важнейшими пунктами между западной границей, Новгородом и Москвой.
Осенью 1608 г. польские советники Лжедмитрия II стали приводить в действие свой план полной блокады Москвы. Военачальники Сапега и Лисовский заняли в числе прочих городов Кашин, Тверь, Старицу, Зубцов и Ржев, контролировали местные дороги и сельскую округу. Память о «литовском нашествии» сохраняется в устных преданиях жителей Тверского края. Во многих деревнях древнерусские курганы называли «паны» и считали, что в них «похоронена литва».
В провинциальных городах начало собираться ополчение для отпора захватчикам. Ведущую роль в организации народной борьбы против интервентов и русских «разбойных людей» играл Ярославль, с которым смыкались восточные тверские земли — Кашин и Калязин. Разрозненное сопротивление волостей и городков принимало организованный характер. Широкое хождение получили грамоты, передаваемые из города в город и содержавшие призывы сплотиться против врага. Борьба местных ополчений с поляками носила ожесточённый характер, многие города и сёла Верхневолжья не раз переходили из рук в руки.
Царь Василий Шуйский, желая получить иностранную военную помощь, направил летом 1608 г. в Новгород своего племянника князя Михаила Скопина-Шуйского для переговоров со шведами.
Во время затянувшихся переговоров князь сумел организовать связь с теми городами, которые уже поднялись или готовились подняться против поляков. Вот что писал Скопин-Шуйский в Вологду о положении на Верхней Волге и Двине: «...а города, господа, Торжок, Старица, Осташков да дворяне и дети боярские Ржевичи, и Зубчане, и Тверичи, Клиняне, да после того, города Холм, Торопец, Ржева Пустая, Невль, Луки Великие, посады и дворяне и дети боярские, государю добили челом», то есть присягнули Василию Шуйскому.
Поляки цепко держались между Новгородом и Москвой, уступая и вновь захватывая городки, торговые рядки и сёла, перекрывая дороги, броды, переправы. В этой ситуации прямой поход русских и шведских отрядов к Москве представлялся рискованным. Весной 1609 г. Скопин-Шуйский разработал план военных действий и избрал Тверь промежуточным пунктом наступления.
В начале мая из Новгорода выступил большой отряд воеводы Чеглокова, к которому на долгом пути должны были присоединиться другие отряды с севера и из Замосковного края, а также ополчение, собиравшееся под Смоленском. Преследуя отступающего противника, 15 мая 1609 г. русское войско в сражении у с. Каменка под Торопцем нанесло поражение полякам и освободило город.
Оттуда отряд Чеглокова прошёл по западной части Верхневолжья и занял Торжок. Поляки осадили город, но смелые действия русского воеводы заставили врага отступить к Твери.
Скопин-Шуйский быстро собирал свои войска, включая в них подходящие отовсюду подкрепления. 11 июля 1609 г., переправившись на правый берег Волги, войско численностью до 20 тыс. человек стало под Тверью. В тот же день поляки атаковали лагерь, но их отбросили. 13 июля русские полки пошли на штурм города и взяли его. Уцелевшие поляки укрылись в кремле. Скопин-Шуйский спешил к Москве и отказался от осады кремля. Наёмники, не получившие богатой добычи, на которую рассчитывали, возмутились и вернулись в Новгород.
Поход на Москву сорвался, и Скопин-Шуйский принял решение накапливать силы в ожидании помощи из северных и замосковных городов. Он спустился левым берегом Волги до Калязинского Макарьева монастыря, выйдя к основным путям сообщения с землями, откуда могла придти подмога. Ратники и местные жители построили укрепления при впадении в Волгу р. Жабни. Скопин-Шуйский ожидал наступления врага именно здесь и не ошибся. Под Калязином решалось, получит ли столица долгожданную помощь, или же поляки, разбив русские войска, принудят московское правительство сдаться.
По 20 тыс. воинов с обеих сторон начали «с четвёрта часу» утра 18 августа жестокий бой. Авраамий Палицын писал о битве на Жабне: «...бысть сеча зла, и сечахуся на многих местех... через весь день».
Сломив сопротивление противника и преследуя его, Скопин-Шуйский нанёс на следующий день у с. Пирогово ещё одно поражение полякам и запорожским казакам, сторонникам самозванца. Победы под Калязином получили большой отзвук. В лагерь приходили отряды ополченцев из разных городов. Вновь прибывших обучали военному делу. В сентябре вернулись две тысячи наёмников под командованием графа Делагарди.
Тем временем польский король Сигизмунд III открыто вторгся в Россию. Поляки взяли Ржев и Зубцов, осадили Смоленск. Тушинский лагерь распался. Польские отряды ушли оттуда под Смоленск на помощь королю, разоряя по пути земли Верхневолжья. Скопин-Шуйский, не встречая сопротивления, в марте 1610 г. вступил в Москву. Но через месяц полководец умер в столице. Достойной замены ему не нашлось, русская армия потерпела ряд поражений. Поляки стремительно продвигались к Москве. Боярское правительство открыло в сентябре врагу ворота столицы.
После этой измены сопротивление захватчикам приобрело характер народной войны. В начале 1611 г. в ополчении, руководимом рязанским дворянином Прокопием Ляпуновым, участвовали, наряду с другими, торопчане, новоторжцы и тверитяне.
Под Псковом объявился ещё один Лжедмитрий. Но «во Твери, в Старице, и в Торжку, и во Ржеве, и на Погорелом Городище воровскому заводу креста не целовали», то есть не присягнули новому самозванцу. «Разбойные люди» пытались захватить весной 1612 г. Тверь, но отряды князя Дмитрия Пожарского оттеснили их.
В октябре 1612 г. второе ополчение, руководимое К. Мининым и Д. Пожарским, окончательно освободило Москву. Однако в разных районах Верхневолжья ещё несколько лет происходили стычки с поляками и казаками. Не раз польская конница совершала рейды к Ржеву, Кашину, Угличу, но верхневолжские крепости устояли. Зато беззащитная сельская округа опустошалась врагом.
В 1616-1618 гг. польский король Владислав, претендовавший на московский престол, вновь развязал войну. Вражеская конница появилась под Кашином и на Бежецком Верхе, летом 1617 г. осадила Ржев, Старицу и Торжок. Обороной Твери руководил князь Д.П. Пожарский-Лопата, родственник освободителя Москвы. Крепость выдержала две осады.
После Деулинского перемирия 1618 г. с Польшей западные тверские города стали пограничными, приняли на постоянное размещение сильные гарнизоны и были дополнительно укреплены.
За долгие годы смуты особенно пострадали те тверские земли (ржевские, зубцовские, старицкие), которые располагались на правом, южном, берегу Волги. Во владениях Троице-Сергиева монастыря в Захожском стане Тверского уезда осталось 36 жилых селений (при 478 пустошах). В Суземском стане Старицкого уезда во владениях Тверского Фёдоровского монастыря обрабатывалось 7 четвертей пашни, а 552 четверти поросли лесом. В писцовой книге Потапа Нарбекова указывается, что в Твери в 1626 г. осталось всего 150 мужчин, способных выполнять государственные повинности, остальные не могли «нести тягло»; 772 посадских места пустовали. Во Ржеве насчитывалось 68 жилых дворов и 236 пустых, в Бежецком Верхе соответственно — 32 и 336, в Старице — 39 и 245. Торопчане в челобитной царю Михаилу Федоровичу в 1626 г. писали: «...город Торопец погорелый, порубежный и беспромышленный, пустой». Для возрождения края требовались дополнительные силы.