Определения белков и аминокислот

Белками, или протеинами, называют высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Белки являются структурной и функциональной основой жизнедеятельности всех живых организмов, они обеспечивают рост, развитие и нормальное протекание обменных процессов в организме. В природе существуют примерно 10¹⁰…10¹² различных белков, обеспечивающих жизнедеятельность организмов всех степеней сложности от вирусов до человека. Белками являются ферменты, антитела, многие гормоны и другие биологические активные вещества.

Для живых организмов характерно большое разнообразие белков, которые составляют основу структуры организма и обеспечивают множество его функций. Главными биологическими функциями белковых веществ являются структурная (кератин волос, ногтей, коллаген соединительной ткани, эластин), каталитическая (ферменты), транспортная (гемоглобин, миоглобин, альбумины сыворотки), защитная (антитела, фибриноген крови), сократительная (актин, миозин мышечной ткани), гормональная (инсулин поджелудочной железы, гормон роста, гастрин желудка) и резервная (овальбумин яйца, казеин молока). Несмотря на сложность строения и многообразие, все белки построены из сравнительно простых структурных элементов – аминокислот. Белки представляют собой полимерные молекулы, в состав которых входят 20 различных аминокислот. Структура α-аминокислот, наиболее часто встречающихся в белках, представлена в Приложении А (таблица А.1). Изменение числа аминокислотных остатков и последовательности их расположения в молекуле белка обеспечивает возможность образования громадного количества белков, отличающихся своими физико-химическими свойствами, структурной или функциональной ролью в организме.

В настоящее время основным методом определения содержания белка в пищевых объектах является метод Кьельдаля. Он основан на сжигании органических компонентов пищи в колбе Кьельдаля в присутствии серной кислоты. Освобождающийся при этом азот определяют титрованием и по его количеству, используя соответствующий коэффициент, вычисляют содержание белка.

Метод по Кьельдалю применяется при возникновении разногласий и является самым надежным. Однако многоэтапность и длительность анализа затрудняет его использование для экспресс-анализа, особенно при работе с большим числом проб.

Среди других методов определения белка большое распространение получили колориметрические методы. Они основаны на измерении оптической плотности растворов, в которых предварительно проведены цветные реакции с белком. Массовая доля белка пропорциональна интенсивности окраски раствора. Для проведения цветных реакций используют биуретовый метод, с применением реактивов Несслера, Лоури и др. Для определения белка, например в молоке, используют, кроме перечисленных, рефрактометрический метод, метод формольного титрования и другие.

Рефрактометрический метод основан на измерении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии и электрофореза.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением, по меньшей мере, двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плоскости, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворённого белка от общего его количества в постоянном объёме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нём индивидуальных компонентов.

Для определения питательной ценности белков используют биологические, химические и ферментативные методы.

Биологические методы дороги в исполнении, требуют длительного времени и большого количества материалов для анализа. Поступивший в организм азот расходуется по двум направлениям: всасывается в пищеварительном тракте, поступает в кровеносную систему (перевариваемый азот) или выбрасывается с фекалиями. Исходя из азотных фракций можно установить различные соотношения, позволяющие охарактеризовать превращение белков в организме.

Для определения степени употребления белков в питании используется несколько критериев:

– коэффициент переваримости (КП) характеризует главным образом способность белка распадаться под действием протеолитических ферментов пищеварительного тракта и всасываться через слизистую кишечника;

– биологическая ценность (БЦ) учитывает ту часть азота, которая фактически используется; она зависит от сбалансированности изучаемых белков по аминокислотному составу и от одновременности введения этих метаболитов в кровеносную систему;

– коэффициент утилитарности белка (КУБ) – это отношение удержанного азота к азоту, потреблённому с пищей (кормами), т.е. суммарная оценка принимаемой в расчёт биологической ценности и переваримости;

– коэффициент эффективности белка (КЭБ) – это отношение прироста массы тела к потреблённому белку.

Химические методы имеют существенные преимущества перед биологическими. Наиболее известные подходы основаны на определении аминокислотного состава, когда выделяются лимитирующие аминокислоты, а затем проводят сравнения со стандартным белком. Далее подсчитывают сумму лимитирующих аминокислот и выражают их в процентах от суммы всех аминокислот либо сравнивают соотношение незаменимых аминокислот с тем же показателем в «идеальном белке».

Ферментативные методы очень популярны, поскольку позволяют искусственно создать условия, максимально приближенные к условиям живого организма.

Известны методы, сочетающие определение состава незаменимых аминокислот гидролизата белка, полученного при его гидролизе пепсином, и осадка, оставшегося нерастворённым после обработки белка пепсином.

Более точными являются методы, использующие сразу несколько ферментов, например, пепсин и трипсин, с аналогичным анализом продуктов гидролиза. Метод заключается в последовательном воздействии на белки вещества исследуемой пробы пищеварительным ферментом in vitro. Накопление продуктов гидролиза по какой-либо цветной реакции с последующим колориметрированием, например, по Лоури, выражают в условных единицах (в данном случае микрограммах тирозина в 1 см³ пробы).

Значения переваримости можно также получить взвешиванием остатков переваривания.