2015-10-16
1131
Еукаріотичний вектор – це невелика молекула, здатна реплікуватись самостійно в еукаріотичних клітинах, містить генетичні маркери, один або декілька сайтів рестрикції для вбудування необхідних послідовностей нуклеотидів.
Еукаріотичні експресуючі вектори мають таку ж будову, як і їх прокаріотичні аналоги, і містять:
еукаріотичний селективний маркер;
еукаріотичний промотор;
відповідні еукаріотичні сайти термінації транскрипції та трансляції;
сигнал поліаденілірування м-РНК.
Еукаріотичні вектори, що реплікуються самостійно в клітині повинні мати відповідний сайт ініціації реплікації, а для функціонування в складі хромосоми клітини господаря в результаті гомологічної рекомбінації повинні мати послідовність, комплементарну певній ділянці хромосомної ДНК. Особливістю еукаріотичних векторів є те, що їх використовують, як правило для одержання експресії вже клонованих послідовностей нуклеотидів, а сам процес клонування проводять в бактеріях. Тому в більшості випадків еукаріотичні вектори сконструйовані як човникові (рис.2). Ці вектори мають дві точки ori, два селективні маркери, такі вектори розроблені для дріжджів, для клітин рослин і тварин. Основним елементом еукаріотичного вектора є сайт клонування, що знаходиться між еукаріотчним промотором та сигналами термінації - поліаденілірування.
Структурні гени транскрибуються в більшості активно функціонуючих еукаріотичних клітин. На відміну від них специфічні гени транскрибуються і транслюються тільки у визначених клітинах. Здатність клітин активувати гени необхідна для підтримання клітинної специфічності та економного використання енергетичних ресурсів клітини. Не дивлячись на індивідуальність регуляторних елементів, всі вони мають промоторну ділянку, що має назву ТАТА-бокс з восьми нуклеотидів, в якому є послідовність ТАТА; послідовність ССААТ (САТ-бокс) та ділянку дінуклеотидів GC, що повторюються. Ці елементи знаходяться на відстані 25, 75 та 90 п.н. відповідно від сайту ініціації реплікації. Крім того, на відстані декількох сотень пар основ знаходиться послідовність нуклеотидів, яка значно підвищує швидкість транскрипції структурних генів і називається енхансерною послідовністю, або енхансером. Таким чином, регуляція транскрипції та трансляції в еукаріотів є надзвичайно складним процесом, в багатьох випадках регуляторні послідовності унікальні, вони можуть активуватись специфічними сигналами в клітинах різного типу в певний час клітинного циклу. В більшості випадків промоторні ділянки підбираються дослідним шляхом, для визначення ефективності промотора використовують гени-репортери, що кодують продукт, наявність якого можна легко визначити. Такий ген розміщують після ділянки ДНК, від якої очікують промоторну активність. Якщо внаслідок такого положення ген-репортер ефективно експресується, робиться висновок, що ділянка ДНК містить функціональний промотор. В багатьох випадках гени-репортери використовуються і як селективні маркери, але не завжди.
Деякі цінні білки складаються з різних поліпептидних ланцюгів. Правильна укладка та зборка поліпептидних ланцюгів in vitro відбувається рідко, in vivo ж відбувається досить ефективно. Для цього розроблено спеціальні еукаріотичні системи для досягнення експресії двох клонованих генів в одній клітині (ссавців): 1) двовекторна система експресії, яка передбачає одночасну трансфекцію клітини двома плазмідами, після якої в ній синтезуються дві субодиниці та збирається повноцінний димерний білок; 2) експресуючий вектор з двома генами, що транскрибуються незалежно; 3) двоцисторний експресуючий вектор, в якому клонові гени розділені ділянкою ДНК, яка після трансляції відіграє роль зв’язуючої послідовності, але не транслюється.
