2017-11-30
198
Реагенты готовы к применению. Используйте реагенты прямо из флаконов.
ИССЛЕДОВАНИЕ
Реагент не обеспечен материалом, дополнительно требуются:
Для метода на плоскости: Планшет, пипетка Пастера, Палочки для смешивания.
Для метода центрифугирования в пробирке: Пробирки 10 х 75 или 12 х 75 мм, пипетки с возможностью дозирования 100 мкл, центрифуга, изотонический раствор (0,85 – 0,9 % натрия хлорида).
Для гелевого метода: Гелевые карты (DiaMedID-Card «NaCl, ферментный тест и холодовая агглютинация», BIO-RAD «Scangelneutral», Grifols «DGGelNeutral»или OrthoClinicalDiagnostics «BiovueSystemReverseDiluent», Пипетка, позволяющая дозировать микролитры, Центрифуга для гелевых карт, раствор для гелевых карт).
Для работы в микроплатах: микроплата с 96 U-образными лунками, Пипетка, позволяющая дозировать микролитры, Центрифуга, Шейкер, изотонический раствор (0,85 – 0,9 % натрия хлорида).
Алгоритм исследования
Метод на плоскости
1. Используйте осадок эритроцитов или цельную кровь.
2. Поместите одну каплю (приблизительно 50 мкл) соответствующего реагента на планшет.
|
|
|
3. Используя пипетку Пастера, добавьте одну каплю осадка эритроцитов или цельной крови (приблизительно 50 мкл) на планшет.
4. Тщательно смешайте эритроциты с реагентом и сформируйте круг (диаметром 2 см).
5. Осторожно вращая планшет, проверьте агглютинацию в течение 1 минуты (реакция начнется в течение нескольких секунд). Неспецифические реакции могут возникнуть при высыхании реактивной формации или нагревания.
Методцентрифугирования в пробирке
1. Используйте 2 % или 5 % суспензию эритроцитов в изотоническом растворе (эритроциты, однократно или многократно промытые изотоническим раствором).
2. Добавьте 100 мкл (одна капля = примерно 50 мкл) соответствующего реагента в каждую пробирку.
3. Добавьте 100 мкл (одна капля = примерно 50 мкл) соответствующей суспензии эритроцитов в каждую пробирку.
4. Хорошо перемешайте путем легкого встряхивания.
5. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре (15 – 30°С) в течение 1 – 15 мин.
6. Центрифугируйте пробирки 1 мин при 2000 об./мин (примерно 800 – 1000 г).
7. Осторожно ресуспензируйте эритроциты и наблюдайте агглютинацию в течение 3 мин. Запишитерезультат.
Непрямая реакция Кумбса
8. Повторите стадии 1 – 4 со свежими образцами или сразу после считывания результатов.
9. Инкубируйте при 37°С 30 минут.
10. Отмойте эритроциты 3 раза в холодном изотоническом растворе
11. Добавьте 100 мкл реактива Кумбса в каждую пробирку.
12. Центрифугируйте пробирку при 1000 об./мин (примерно 180 – 270 г).
13. Осторожно ресуспендируйте эритроциты и наблюдайте агглютинацию в течение 3 минут. Запишите результат.
|
|
|
Гелевыйметод
1. Используйте 0,8 % суспензию эритроцитов в растворе для гелевых карт.
2. Добавьте 50 мкл соответствующей суспензии эритроцитов в каждую микропробирку.
3. Добавьте 25 мкл соответствующей тест-сыворотки в каждую микропробирку. Если используется автоматический метод, добавьте 10 мкл тест-сыворотки. Вообще, 10 мкл может быть использоваться и в ручном методе.
4. Центрифугируйте карты в соответствующей центрифуге не позднее30 минут.
5. Наблюдайте агглютинацию в течение 30 мин. Запишитерезультат.
Работа в микроплатах
1. Используйте 2 % суспензию эритроцитов в изотоническом растворе (эритроциты могут быть однократно или до 3-х раз промытые изотоническим раствором).
2. Добавьте 50 мкл соответствующей суспензии эритроцитов в каждую лунку.
3. Добавьте 50 мкл соответствующей тест-сыворотки в каждую лунку.
4. Смешивайте в течение 30 сек на шейкере с максимальной скоростью.
5. Центрифугируйте микроплату в соответствующей центрифуге в течение 30 сек при 400 х г.
6. Шейкируйте 30 мин со средней скоростью, наблюдайте агглютинацию. Запишитерезультат.
