2017-12-16
287
ЛЕКЦИЯ 5.1.
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ФЕРМЕНТОВ
Генетическая инженерия ферментов представляет собой искусственное создание ферментов с использованием методов генной инженерии: технологий рекомбинантных ДНК или молекулярного клонирования. С помощью генетической инженерии могут создаваться:
· ферменты, называемые рекомбинантными ферментами (аналогичные природным либо модифицированные);
· клетки, экспрессирующие ферменты, – рекомбинантные клетки (фермент может быть необходим не в изолированном виде, а в виде экспрессирующих его клеток);
Технологии рекомбинантных ДНК
Основу генной (или генетической) инженерии составляют технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные ДНК – это искусственно созданные молекулы ДНК, представляющие собой гены (фрагменты ДНК), встроенные в специальные молекулы ДНК (векторы), которые могут обеспечить увеличение копий гена, а также его экспрессию. Умножение гена происходит вместе с делящимися клетками ‒ клоном, несущим рекДНК, поэтому технологии рекомбинантных ДНК также называют молекулярным клонированием.
Основные этапы молекулярного клонирования
Основными этапами молекулярного клонирования являются следующие процедуры:
| Создание рекДНК | 1) получение гена, кодирующего фермент; |
| 2) вставка гена в вектор; | |
| Клонирование | 3) трансформация клеток рекомбинантными ДНК; |
| 4) отбор клонов; | |
| 5) функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация и экспрессия гена) |
Кроме перечисленных основных этапов могут присутствовать и дополнительные. Так ген, кодирующий фермент, может быть подвергнут модификациям, в частности, сайт-специфическим изменениям с целью изменения свойств фермента. В процессе создания экспрессионной системы могут быть использован ряд подходов для увеличения эффективности экспрессии – оптимизация экспрессии клонированных генов.
Последний этап молекулярного клонирования зависит от его целей. Если конечным продуктом является сам фермент, то он выделяется из клеток и подвергаться очистке. Может также использоваться реакция, катализируемая ферментом в виде рекомбинантных клеток.
В зависимости от того, какие клетки используются для молекулярного клонирования, выделяют прокариотические и эукариотические системы. Эти системы различаются используемыми векторами и регуляторными элементами. Прокариотические системы более просты. Поэтому, если применение клонирования в бактериальных клетках возможно, то предпочтительно используются они. Однако из-за специфических особенностей экспрессии синтеза эукариотических ферментов часто прокариотические системы использовать невозможно. В таких случаях необходимы эукариотические системы.
На сегодняшний день генетическая инженерия представляет быстро развивающуюся область науки и технологий и ее рассмотрению может быть посвящен целый отдельный курс. Поэтому нижеприведенное описание этапов генно-инженерных манипуляций представляет собой только краткое их описание.
