Кольорові реакції на білки і амінокислоти

Матеріали, реактиви, обладнання

1%-ний розчин казеїну, 0,1 М розчини амінокислот лізину, тирозину, триптофану, 10%-ний і 30%-ний розчини NaOH, 1%-ний розчин CuSO₄, сечовина (кристали), 0,5%-ний розчин нінгідрину в ацетоні, концентрована нітратна кислота, концентрована сульфатна кислота, концентрована оцтова кислота, штативи з пробірками, піпетки.

 

Присутність білків в біологічних об’єктах або розчинах можна визначити за допомогою кольорових реакцій, які обумовлені наявністю амінокислот в білках, їх специфічними групами.

Існують два різновиди кольорових реакцій:

- універсальні – біуретова (на всі білки) і нінгідринова (на всі α-амінокислоти і білки);

- специфічні – тільки на деякі амінокислоти як у складі молекули білка, так і в розчинах окремих амінокислот.

Кольорові реакції широко використовують для виявлення білкової природи речовин, вивчення амінокислотного складу різних природних білків і пептидів, для ідентифікації індивідуальних амінокислот. Багато з них є досить чутливими та високо специфічними, що дозволяє відкривати незначні кількості білків ті чи інші амінокислоти в лікарських засобах, у гідролізатах білків, у біологічних рідинах і тканинах організму. Кольорові реакції знайшли застосування у клініко-біохімічних лабораторіях при проведенні різних аналізів та в науково-дослідній роботі.

Біуретова реація

В лужному середовищі в присутності іонів Сu²⁺ розчини білків набувають фіолетового забарвлення з червоним або синім відтінком залежно від кількості пептидних зв’язків у молекулі. Продукти неповного гідролізу білку, що містять не менше двох пептидних зв’язків, дають біуретову реакцію з червоним відтінком. Реакція обумовлена наявністю пептидних груп, які у лужному середовищі утворюють з іонами Сu²⁺ забарвлений комплекс. Комплекси можуть утворюватися за участю двох і трьох атомів Нітрогену пептидних груп, що обумовлює відтінок забарвлення. У великих концентраціях біуретову реакцію дають також амінокислоти гістидин та аспарагін. Свою назву біуретова реакція отримала від похідного сечовини – біурету, який також дає цю реакцію:

Хід роботи

1. В одну пробірку наливають 5 крапель розчину білків. Потім додають 10 крапель 10%-ного розчину NaOH і одну краплю 1%-ного розчину CuSO₄. Вміст пробірки перемішують. З’являється забарвлення з відповідним відтінком.
2. В суху пробірку поміщають декілька кристаликів сечовини і нагрівають на слабкому вогні. Сечовина плавиться. Коли розплавлена маса почне тверднути, нагрівання припиняють. Утворюється біурет. До нього додають розчини NaOH і CuSO₄, як описано вище. При перемішуванні з’являється рожеве забарвлення.

 

Нінгідринова реакція

Амінокислоти, пептиди та білки дають синє або фіолетове забарвлення з нінгідрином (гідрат трикетогідриндену). Реакція характерна для α-аміногруп амінокислот.

При нагріванні білків з водним розчином нінгірдрину виділяються СО₂ і NH₃, нінгідрин відновлюється, окислюючи α-вуглецевий атом амінокислот з утворенням альдегіду. Потім відновлений нінгідрин взаємодіє з NH₃ і другою молекулою нінгідрину. В результаті утворюється кольоровий продукт (синє або фіолетове забарвлення) мурексидної будови.

 

Хід роботи

Наливають в пробірку 1 мл розчину амінокислоти, додають 5 крапель 0,5%-ного розчину нінгідрину та нагрівають. З’являється фіолетове забарвлення. Реакцію повторюють з розчином білка.