Функциональная структура генов

 

В 1961 г. Жакоб и Моно доказали, что все гены можно подразделить на структурные и регуляторные. После выделения репрессора – продукта, синтезируемого под контролем гена‑регулятора (М. Пташне, 1967; В. Гильберт и Б. Мюллер‑Хилл), вопрос о структурной организации генов стал особенно актуальным. Мутационная дробимость гена и определение минимального размера участка ДНК, подвергающегося мутированию (мутона), выяснение минимального отрезка ДНК, на границах которого может произойти перекрест (рекона), а также определение функциональной единицы генетической активности (цистрона) было важным шагом в познании структурной организации генетического материала.

Однако в самые последние годы появились новые данные, позволяющие значительно расширить наши представления о структурной организации генов. Было открыто явление многократной повторяемости генов, по крайней мере, у некоторых, а возможно, и у всех представителей высших организмов.

Было найдено, что количество ДНК в хромосомах некоторых растений (роды Lilium, Lupinus, Vicia, Thyantha) и насекомых, имеющих одинаковое число хромосом и близких в систематическом отношении, различается в 4‑60 раз. Для объяснения столь резких различий Г. Кэллен в 1967 г. предложил гипотезу 6 существовании многих копий одних и тех же генов (гипотеза «хозяев и рабов»). Согласно представлениям Кэллена, наличие серий повторяющихся последовательностей генов, из которых в любой данный момент работает лишь одна копия («хозяин»), а остальные копии находятся в репрессированном состоянии («рабы»), дает возможность объяснить не только большие различия в содержании ДНК в ядре близких видов, но и стабильность генетического материала в эволюции. Перед началом репликации ДНК может проходить процесс коррекции (унификации) основной и подчиненных копий генов. Предполагается, что в ходе такой коррекции соответствующие ферменты могли бы «сверить» структурные совпадения нуклеотидов по длине каждой из копий генов и устранить несовпадающие участки.

Пока трудно судить о том, насколько справедлива эта гипотеза, пег уже накапливаются факты, подтверждающие ее основные положения[189].

 

 

Генетический код.

 

Постановка проблемы молекулярной природы генетического кода стала возможной после установления строения материального носителя генетической информации – молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты. Гипотеза о строении ДНК, полностью подтвержденная последующими экспериментами, была предложена в 1953 г. Ф. Криком и Дж. Уотсоном (см. также главу 23).

Многочисленные эксперименты биохимиков и генетиков дали убедительные доказательства в пользу того, что основная функция генов заключается в кодировании белков. Это было предсказано еще Бидлом и Тейтумом (1944), провозгласившими правило: «один ген – один фермент». Данная формула получила подтверждение, но в нее было внесено одно уточнение. Так как один фермент может состоять из нескольких белковых молекул (полипептидных цепей), то следует считать, что один ген определяет одну полипептидную цепь.

Выяснение основной функции гена как хранителя информации о строении определенной полипептидной цепи поставило перед молекулярной генетикой вопрос исключительной важности: каким образом осуществляется перенос информации от генетических структур (ДНК) к морфологическим структурам, иначе говоря, каким образом записана генетическая программа и как она реализуется в клетке.

Согласно модели Уотсона‑Крика, генетическую информацию в ДНК несет последовательность расположения оснований. Таким образом, в ДНК заключены четыре элемента генетической информации. В то же время в белках было обнаружено 20 основных аминокислот. Необходимо было выяснить, как язык четырехбуквенной записи в ДНК может быть переведен на язык двадцатибуквенной записи в белках. Решающий вклад в разработку этого механизма был внесен Г. Гамовым (1954, 1957). Он предположил, что для кодирования одной аминокислоты используется сочетание из трех нуклеотидов ДНК[190]. Эта элементарная единица наследственного материала, кодирующая одну аминокислоту, получила название кодона.

Хотя предположение Гамова о тринуклеотидном составе кодона выглядело логически безупречным, доказать его экспериментально долгое время не удавалось. На протяжении семи лет со времени публикации первой работы Гамова (1954) проблему организации генетического кода пытались чисто теоретически разрешить многие исследователи.

Не вдаваясь в подробности, все тиры предложенных кодов (за небольшим исключением) можно разделить на три типа: сплошной перекрывающийся код, сплошной неперекрывающийся код и код с запятыми. В конце 1961 г., когда многим стало казаться, что эта проблема вряд ли будет в ближайшие десятилетия разрешена, была опубликована работа кембриджской группы исследователей (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Бреннер и Р. Ваттс‑Тобин), выяснивших тип кода и установивших его общую природу. Важным моментом в их работе было то, что они с самого начала строго поставили вопрос о роли начальной, стартовой точки в гене. Их основной постулат, который они блестяще доказали, заключался в том, что в каждом гене есть строго фиксированная начальная точка, с которой фермент, синтезирующий РНК, начинает «прочтение» гена, причем читает его в одном направлении и непрерывно. Экспериментальная часть работы базировалась на модели rII‑мутантов фага Т4. Использовав эту модель, авторы доказали, что размер кодона действительно равен трем нуклеотидам и что наследственная информация, записанная в ДНК, читается от начальной точки гена «без запятых и промежутков».

Доказательство свелось к получению точечных rII‑мутантов, супрессоров этих мутантов и различных рекомбинантов. Крик с сотрудниками воспользовались свойством весьма интересных мутагенов – красителей акридинового ряда – вызывать вставку или выпадение одного нуклеотида в ДНК. Исходя из гипотезы, что чтение генетической матрицы осуществляется с фиксированной точки тройками оснований, авторы резонно предположили, что при вставке и выпадении нуклеотидов, начиная с измененной точки, чтение ДНК будет осуществляться неверно:

 

 

Очевидно, что при обоих повреждениях можно добиться возвращения к правильной фазе чтения единственным образом: в первом случае при выпадении либо самой лишней буквы, либо буквы, расположенной рядом с ней; во втором случае при вставке вместо выпавшей буквы находящейся по соседству с ней. В обоих случаях произойдет восстановление нормального (дикого) генотипа и фенотипа, если буква, исправляющая чтение, появится где‑то рядом по соседству с измененной точкой:

 

 

Получив под действием аналога акридина – профлавина – ряд rII‑мутантов, потерявших нормальную фазу чтения на всем протяжении гена, и осуществив затем вторую мутацию противоположного знака по соседству с первым повреждением (супрессоры первых мутаций), авторы получили фаги с псевдодиким фенотипом.

Доказательство трехбуквенного состава генетического кода было получено в дальнейших экспериментах, когда при помощи рекомбинации авторы совместили в одном геноме три мутации одного знака. Были получены фаги, несшие по три мутации вставки или по три мутации выпадения. Так как изменение чтения на три буквы должно было сместить чтение на число букв, кратное величине кодона, следовало ожидать восстановления псевдодикого фенотипа:

 

 

Именно этот результат и был зарегистрирован в эксперименте. Фаги псевдодикого фенотипа возникали только при сочетании трех повреждений одного знака, а не при сочетании двух или четырех одинаковых повреждений.

 

 

Репликация ДНК.

 

Причиной быстрого признания гипотезы Уотсона и Крика послужило то, что авторы не только предложили модель строения ДНК, но и рассмотрели механизм ее репликации. Согласно их гипотезе, последовательность оснований в одной нити ДНК однозначно задавала последовательность оснований в другой нити. Следует подчеркнуть, что абсолютно та же идея репликации в общем виде (без указания на ДНК‑овую природу генетической информации) была предложена задолго до этого советским ученым Н.К. Кольцовым (1928).

Уотсон и Крик далее предположили, что две нити ДНК раскручиваются и на каждой из них в соответствии с правилами комплементарности синтезируются дочерние нити. Таким образом, каждая новая молекула ДНК должна содержать одну родительскую нить и одну дочернюю. Этот тип (полуконсервативный) репликации к концу 50‑х годов был экспериментально обоснован в опытах на бактериях (М. Мезельсон, Ф. Сталь, Д. Рольф). Опыты на высших организмах также косвенно говорили о правильности этого вывода (Д. Тейлор и др.). В это же время А. Корнберг выделил фермент, который, как он считал, осуществлял синтез ДНК (Нобелевская премия, 1959). Для работы фермента было необходимо наличие затравочной ДНК и всех четырех предшественников ДНК (дезоксирибонуклеозидтрифосфатов). В последующем десятилетии биохимики получили огромное количество фактов о характере протекания репликационного процесса. Было выделено и охарактеризовано несколько типов ферментов, осуществляющих репликацию (ДНК‑полимераз).

В конце 60‑х годов было установлено, что наряду с процессом нормальной полуконсервативной репликации в клетках всех без исключения организмов (в том числе и человека) осуществляется еще один процесс репликации ДНК, протекающий во время репарации ДНК. Если ДНК оказывается поврежденной после воздействия на нее ряда физических и химических факторов, специальные репарирующие ферменты (пуклеазы) вырезают эти поврежденные участки, после чего бреши заделываются специальными репарирующими ДНК‑полимеразами. Не исключено, что выделенный Корнбергом фермент как раз относится к этому виду полимераз.

Воспользовавшись репарирующими ферментами, А. Корнберг, Р. Синсхеймер и М. Гулиан в 1969 г. смогли в бесклеточной системе воспроизвести синтез инфекционной фаговой ДНК для одного из мельчайших фагов – ϕХ174. Авторы использовали готовую родительскую нить ДНК этого фага и на ней синтезировали копии ДНК.

Заново синтезировать ген удалось в 1968–1971 гг. американскому исследователю Г. Коране (Нобелевская премия, 1968). Он чисто химически собрал ген для одной из транспортных РНК, последовательно добавляя к синтезируемой молекуле новые нуклеотиды.

Принципиально новый тип репликации ДНК был доказан в конце 1970 г. в лабораториях С. Шпигельмана (на лимфоцитах человека) и Г. Темина (на фибробластах цыпленка и крысы, зараженных вирусом саркомы Рауса). Эти исследователи установили, что имеется особый фермент ДНК‑полимераза, использующий в качестве матрицы не ДНК, а РНК. Сама идея о том, что РНК может послужить шаблоном для синтеза ДНК, была высказана в 1961 г. советским генетиком С.М. Гершензоном и в 1964 г. американцем Теминым. После выделения этого фермента (получившего название обратной транскриптазы) сразу в трех лабораториях в США в 1972 г. удалось синтезировать гены, кодирующие гемоглобин животных и человека (Шпигельман и соавторы; Д. Балтимор и соавторы и Ф. Ледер и соавторы). Затем обратная транскрипция была обнаружена у широкого круга объектов.

Новым моментом в схеме репликации ДНК было установление того, что репликация осуществляется, по‑видимому, участками размером около 1000 нуклеотидов (Р. Оказаки, 1968 и позднее). Прерывистый синтез ДНК («фрагмента Оказаки») был обнаружен как в микробных клетках и у фагов, так и в клетках растений и животных. Правда, окончательного доказательства, что репликация ДНК происходит фрагментами, до сих пор не получено.