Методы белковой химии: качественные и количественные методы на белки. Определение первичной структуры белка

Качественноеопределениебелков - используются осадочные пробы с органическими кислотами (трихлоруксусная, сульфосалициловая кислоты), цветные реакции на определенные аминокислоты в составе белка (реакция Фоля, ксантопротеиновая реакции и др).

Количественное определение белков. Определяется: 1) по содержанию в них азота (для этого белковый препарат сначала подвергают минерализации, а затем определяют содержание азоту по реакции Несслера); 2) биуретовый метод – основан на образовании окрашенных в сине-фиолетовый цвет комплексов между ионами меди и пептидными связями белков;3) метод Лоури, который основан на способности медных комплексов белков восстанавливать реактив Фолина; 4) метод Бредфорда, который основан на способности белков связывать красители – бромфеноловый синий, кумасси голубой;

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования(последовательность). Таким образом определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:
1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.
2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов.
3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Наиболее широко используют ферментативный гидролиз полипептида протеолитическим ферментом – трипсином. Он расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа остатков лизина или аргинина.

Затем в каждом фрагменте устанавливают аминокислотную последовательность. Для определения N-концевой аминокислоты применяется фенилтиогидантоиновый метод Эдмана. Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана реализован в специальном приборе – секвенаторе.

Завершающим этапом установления первичной структуры белка является восстановление порядка, в котором фрагменты располагались в исходном полипептиде. Чаще всего для этой цели используют подход известный как метод перекрывающихся белков