Характеристика витамина B12 и основные продуценты при его получении (№12 август 2015)

Л.Ф. Сахибгараева¹*, А.И. Марахова¹, Д.К. Смагулова¹, И.Е. Станишевская¹

1 – Институт биохимической технологии и нанотехнологии РУДН, Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 10/2

* E-mail: Lilya03s@mail.ru
Тел.: 8 (499) 936 86 85

Резюме: Исследованылитературные данные в области применения и дефицита витамина В₁₂ в организме человека. Приведена характеристика штаммов микроорганизмов, которые являются продуцентами данного витамина при микробиологическом синтезе.

Ключевые слова: витамин В₁₂, цианокобаламин, дефицит, род Pseudomonas spp., род Propionibacterium spp., микробиологический синтез

Characteristics of Vitamin B₁₂ and its main producers

L.F. Sahibgaraeva¹*, A.I. Marahova¹, D.K. Smagulova¹, I.E. Stanishevskaya¹

1 – Institute of Biochemical technology and nanotechnology PFUR, 10/12, Miklukho-Maklaya str., Moscow, 117198, Russia

Abstract. Weinvestigated the published data for the application and vitamin B₁₂ deficiency in humans. The characteristic of strains of microorganisms which are producers of the vitamin in the microbiological synthesis.

Keywords: Vitamin B₁₂, cyanocobalamin, Pseudomonas spp., Propionibacterium spp., microbiological synthesis

 

ВВЕДЕНИЕ

Витамины играют в жизни человека огромную роль, являясь незаменимыми факторами питания. Они необходимы для всех систем нашего организма. Витамины группы В активируют белковый, жировой и углеводный обмен, тем самым участвуя в кроветворении и нормальном функционировании нервной ткани [1].

Витамин В₁₂ – сложное неполимерное соединение, содержащее микроэлемент кобальт, который важен для жизнедеятельности организма человека. Витамин В₁₂ имеет огромное значение в медицине и представлен несколькими родственными соединениями, однако, как правило, под витамином В₁₂ подразумевают цианокобаламин. В настоящее время широко изучены свойства и функции витамина В₁₂, но цианокобаламин, его метаболиты и их аналоги продолжают привлекать внимание химиков, биохимиков и медиков. Также исследованы этиология и патогенез витамин В₁₂-дефицитной анемии (пернициозной анемии) и разработана терапия этого заболевания [2-11].

В работе приведены основные свойства, функции витамина В₁₂ и характеристика различных штаммов микроорганизмов, которые являются продуцентами при его биосинтеза.

 

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИТАМИНА В₁₂

Витамин В₁₂ (цианокобаламин) – имеет большое значение в жизнедеятельности человека. Витамин В₁₂ возобновляет запасы железа в организме человека, регулирует основные обменные процессы в организме, способствует повышению иммунного статуса организма, участвует в делении клеток, синтезе дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой кислот, регулировании жирового и аминокислотного обмена, улучшает качество крови. При взаимодействии витамина В₁₂ с молекулами фолиевой кислоты вырабатывается достаточное количество холина для обеспечения устойчивости организма к повседневным стрессам. Витамин В₁₂ совместно с витамином А участвует в синтезе тканей тела, обеспечивая вступление каротиноидов (провитамины А) в обмен веществ и превращение их в активный витамин А. Суточная норма витамина B₁₂ для взрослых – от 2 до 7 мкг, для детей – от 0,3 до 1 мкг, общее содержание в организме человека - 2-5 мг, бóльшая часть аккумулируется в печени. Витамин B₁₂ участвует в важнейших биохимических процессах миелинизации нервных волокон, установлена достоверная связь наличия депрессивного состоянии у человека с содержанием витамина В₁₂ [1-11].

Витамин В₁₂ был выделен из печени в 1948 г., а в 1973 г. - синтезирован в лабораторных условиях. Витамин В₁₂ представляет собой сложную молекулу, состоящую из тетрапирролового кольца с атомом кобальта в центре. Различают формы витамина В₁₂: цианокобаламин (рис.1), гидроксикобаламин, метилкобаламин и 5-дезоксиаденозилкобаламин, содержащих разные заместители у атома кобальта – циано-, гидроксильную, метильную группу или дезоксиаденозильный радикал.

РИСУНОК НЕ ПРОГРУЗИЛСЯ

Рисунок 1 – Структурная формула цианокобаламина [2]

Цианокобаламин (α-(5,6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид) наиболее широко используется в медицинской практике в качестве лекарственного препарата, так как наряду с гидроксикобаламином (оксикобаламин) характеризуется стабильностью при хранении и высокой биологической активностью, в отличие от метилкобаламина и 5-дезоксиаденозилкобаламина, которые нестабильны и являются коферментами в двух жизненно важных биохимических реакциях. Цианокобаламин биологически неактивен и используется тканями только после превращения его в коферментные формы. Другие представители группы витамина В₁₂ отличаются от цианокобаламина тем, что вместо группы CN- содержат молекулу воды или молекулу аммиака [2, 3, 6, 12].

Дефицит витамина В₁₂ приводит к тяжелейшим нарушениям процесса кроветворения - пернициозной анемии, иммунодефициту, разнообразным симптомам со стороны желудочно-кишечного тракта, поражению нервной системы - подострой дегенерацией спинного мозга с поражением задних канатиков, психическим расстройствам, у больных витамин–В₁₂- дефицитной анемией имеются нарушения печеночного кровотока [1,7,9,10]. В статье [6] авторы приходят к выводу, что дефицит витамина В₁₂ не всегда приводит к развитию анемии, степень дефицита витамина далеко не всегда со- ответствует степени тяжести анемии. Поскольку ежедневная потеря витамина В₁₂ очень невелика (2–5 мкг), то истинный алиментарный его дефицит встречается крайне редко. Дефицит витамина B₁₂ характерен для вегетарианцев и вскормленных их молоком грудных детей, встречается у 30% пожилых людей.

В настоящее время дефицит витамина В₁₂ обусловлен возрастанием потребления продуктов, подвергнутых технологической обработке, употребление «фаст фуда», дефицит витаминов группы В может возникнуть при развитии паразитарного заболевания, на фоне проблем с пережевыванием и расстройствами пищеварения, гипоацидного и атрофического гастритов. Витамин В₁₂ синтезируется исключительно микроорганизмами: бактериями, актиномицетами и сине-зелёными водорослями. Этот витамин вырабатывается микроорганизмами в пищеварительном тракте животного и человека как продукт деятельности микрофлоры. Учитывая, что синтез витамина В₁₂ кишечной флорой человека незначителен, витамин должен поступать в организм с пищей. Наиболее богаты витамином В₁₂ печень, почки, моллюски, раки, крабы, молочные продукты. Препараты витамина В₁₂ применяют, как правило, в виде инъекций. При пероральном приёме витамина В₁₂ исследователи отмечают слабую всасываемость витамина, так всасываемость цианокобаламина и метилкобаламина составляет всего 1–3% [1,6,9,10,13].

БИОСИНТЕЗ ВИТАМИНА В₁₂ МИКРООРГАНИЗМАМИ. ОСНОВНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ

Химический синтез витамина сложен, состоит из 70 стадий, поэтому экономически целесообразно производить витамин В₁₂ микробиологическим способом. В настоящее время для биосинтеза витамина В₁₂ в промышленности используют в основном штаммы представителей родов бактерий: Propionibacterium, Pseudomonas и Methanobacteria [5, 14-19].

Завод препаратов микробиологического синтеза «Энзим» в качестве продуцентов микробиологического синтеза витамина В₁₂ и его коферментной формы применяет пропионовокислые бактерии. Кормовые концентраты, содержащие витамин В₁₂, получают на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) с помощью комплекса метанобразующих бактерий [20].

Пропионовокислые бактерии (Propionibacterium freundenreichii, P.acidopropionici, P. shermanii) являются активными продуцентами витамина В₁₂, липиды пропионовокислых бактерий входят не только в структурные элементы клеток, но и играют еще роль защитных компонентов против действия некоторых антибиотиков. Синтез витамина зависит от условий культивирования: температура и продолжительность проведения процесса, состав питательной среды, содержание ионов кобальта, используемого в качестве предшественника при синтезе витамина В₁₂. В естественных питательных средах содержание кобальта минимально, поэтому в фоновую питательную среду необходимо добавлять ионы Co²⁺, которые влияют на выход биомассы и синтез витамина В₁₂ [5, 17-19]. В работе [21] авторы предлагают применять ультразвуковую модуляцию метаболизма пропионовокислых бактерий для интенсификации промышленного получения витамина В₁₂: исследования показывают, что подбор определённых условий озвучивания сред позволяет направленно изменять соотношение различных форм витамина в среде при культивировании.

В отечественном производстве витамина В₁₂ в качестве продуцента применяют Propionibacterium freudenreichii var. Shermanii, например, в работе [10] предложен способ микробиологического синтеза витамина В₁₂ при помощи штамма бактерий Propionibacterium shermanil В-4891, позволяющий достигать концентрацию витамина В₁₂ в культуральной жидкости до 40 мкг/мл. В промышленном производстве пропионовокислые бактерии культивируют посредством периодического культивирования в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и аммония, при рН около 7,0. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол - предшественник витамина В12 и продолжают ферментацию еще 3 суток. В отсутствии предшественника бактерии синтезируют соединения, не имеющие клинического значения. Витамина В₁₂ накапливается в клетках бактерий, поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5-5,0 при температуре 85-90°С в течение 60 мин. в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита), после чего водный витамина В₁₂ раствор охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50 % раствором едкого натра. К раствору добавляют алюминия сульфат и хлорид железа трехвалентного (Al₂(SO₄)₃* 18Н₂О и безводный FeCl₃) для коагуляции белков и фильтруют через фильтр – пресс. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3-4 °С из водноацетонового раствора Для предотвращения разложения В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Во избежание попадания посторонней микрофлоры культивирование следует проводить в аппаратуре закрытого типа в стерильных условиях. Питательная среда перед подачей в посевные аппараты должна стерилизоваться. Таким образом, можно получить не только смесь цианокобаламнов и оксикобаламинов, но и коферментную (связанную с белком микробной клетки) легкоусвояемую форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом [16, 22, 23].

В качестве продуцента витамина В₁₂ также используют культуру Pseudomonas fluorescens штамм ВКМ В-2224Д. Достоинствами этого штамма являются высокий выход витамина по сравнению с другими продуцентами, например Propionibacterium shermanii, относительная устойчивость к заражению посторонней микрофлорой, непатогенность. Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2224Д растет при 28-32 ^oС и рН 7-7,2 и постоянном перемешивании. Рост культуры происходит параллельно с биосинтезом витамина В₁₂ в аэробных условиях. Продуктивность культуры за 150 ч роста ферментации составляет 130-150 мкг/мл [14].

В Японии производство витамина осуществляют при помощи бактерий Acenetobacterium, Rhizobium Colalaminogenum FERMBP-4429, Propionibacterium shermanii или freundenreiichii, устойчивых к пропионовой кислоте. При данных способах получения витамина В₁₂ концентрация витамина B₁₂ в культуральной жидкости составляет 60-70 мкг/мл [22]. В ряде стран (Франция, Китай, Корея и др.) для промышленного получения кобаламинов в аэробных условиях используются штаммы бактерии Pseudomonas denitrificans, трансформированные плазмидой. Применение рекомбинантных штаммов Pseudomonas denitrificans позволяет повысить продуктивность биосинтеза витамина В₁₂ [14, 24-26].

Промышленное получение витамина В₁₂ с использованием штаммов бактерий Pseudomonas, Propionibacterium и др.позволяет полностью удовлетворить потребности медицины, как в настоящее время, так и в будущем.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная статья была посвящена характеристике продуцентов витамина В₁₂. Наиболее часто в качестве продуцентов витамина В₁₂ используют культуры представителей родов Pseudomonas, Propionibacterium и метаногенных бактерии, позволяющие получать высокий выход конечного продукта с относительной устойчивостью к заражению посторонней микрофлорой.

Также были исследованы основные свойства витамина В₁₂. Его применяют в медицине при лечении пернициозной анемии, нарушениях в нервной системе и головном мозге. Дефицит витамина в организме человека может привести к серьезным нарушениям обмена веществ, нервной системы и функций мышц.