Определение концентрации спермиев

Концентрация спермиев определяется в каждом эякуляте. Эти данные необходимы для расчета кратности разбавления спермы. Кратность разбавления устанавливается с таким расчетом, чтобы в каждой дозе разбавленной спермы было предусмотренное ГОСТом число спермиев.

Концентрацию спермиев можно определить несколькими методами: подсчетом в камере Горяева; по J оптическому стандарту; при помощи фотоэлектроколориметра; электронным счетчиком частиц.

Достаточно точным методом определения концентрации спермиев является подсчет в камере Горяева. Однако он утомителен и требует много времени — 15—20 мин на оценку каждого эякулята.

Для определения концентрации спермиев этим методом цельную сперму разбавляют в меланжере 3%-ным раствором натрия хлорида: быка — в 100 раз, барана — в 200 раз, хряка и жеребца — в 20 раз. Камеру Горяева с притертым покровным стеклом заряжают разбавленной спермой, кладут на предметный столик микроскопа, отыскивают сетку и, отрегулировав освещенность поля зрения, производят подсчет спермиев в пяти больших квадратах, расположенных по диагонали. Для пересчета на 1 см3 пользуются упрощенными формулами:

С=Н/100 (баран); С = Н/200 (бык) С = Н/1000 (хряк, жеребец),

где С — концентрация спермиев в млрд/мл;

Н — число подсчитанных спермиев в пяти больших квадратах.

Применение оптического стандарта основано на том, что чем больше мутность исследуемой спермы, тем выше концентрация спермиев. Этот метод легко и быстро выполним, но по точности значительно уступает прямому подсчету спермиев.

Оптический стандарт для определения концентрации спермиев в сперме хряка (автор С.И. Сердюк) представляет собой запаянную пробирку из прозрачного стекла диаметром 12—14 мм; в ней содержится жидкость, имитирующая по степени мутности сперму хряка с концентрацией спермиев 5 млн/мл. При определении концентрации в другую пробирку того же диаметра наливают 1—2 мл 1%-ного раствора натрия хлорида и вносят микропипеткой как можно точнее 0,1 мл профильтрованной спермы. Снова добавляют раствор натрия хлорида, пока степень мутности не сравняется с таковой стандарта. Затем вычисляют концентрацию спермиев. Если, например, на 0,1 мл спермы пошло 2,9 раствора натрия хлорида (степень разведения 30 раз), концентрация спермиев в исследуемом эякуляте равна 150 млн/мл.

Применение фотоэлектроколориметра (ФЭК-56) или фотодиод КФК-2 позволяет оценить эякулят по концентрации спермиев за 1—2 мин.

Принцип работы ФЭК заключается в том, что пучок света от специальной лампы проходит через светофильтр, затем через кювету с исследуемой спермой попадает на селеновый фотоэлемент (ФЭК-56) или фотодиод (КФК-2), преобразующий световую энергию в электрическую. Электрическая энергия подводится к миллиамперметру, стрелка которого отклоняется в сторону от нуля. Степень отклонения стрелки зависит от величины электрического тока, а она обратно пропорциональна оптической плотности спермы. Для перевода найденной величины оптической плотности в соответствующую ей концентрацию спермиев необходимо заранее подготовить калибровочную шкалу или найти коэффициент-множитель.

Для построения калибровочной шкалы используют разведения спермы с различной концентрацией спермиев. Разбавление спермы проводят путем добавления плазмы спермы, которую получают центрифугированием спермы при 5—8 тыс. об/мин в течение 15-20 мин.

Сперму разбавляют спермальной плазмой из расчета получения разведения с интервалом концентрации спермиев 0,1—0,15 млрд/мл.

Концентрацию спермиев в каждом разведении уточняют путем подсчета в камере Горяева. Приготовленные разведения колориметрируют и находят соответствующие величины оптической плотности.

При построении калибровочной шкалы в определенном масштабе на миллиметровой бумаге по горизонтальной оси откладывают значения

оптической плотности, а по вертикальной — соответствующие величины концентрации спермиев. Точки пересечения восстановленных от указанных величин перпендикуляров соединяют диагональной линией.

Калибровочную шкалу строят для каждого ФЭК, для каждого вида животных отдельно. В связи с тем, что по мере износа фотоэлементов показания на ФЭК могут изменяться, калибровочную кривую ежемесячно сверяют с показаниями счетной камеры Горяева.

Для получения коэффициента-множителя необходимо провести исследование 15—20 эякулятов. Концентрация спермиев в каждом эякуляте определяется с помощью фотоэлектроколориметра и подсчетом в камере Горяева. Полученные данные суммируют отдельно по каждому способу, а затем сумму концентрации (С) делят на сумму оптической плотности (Д):

С/Д = коэффициент-множитель

При определении концентрации спермиев полученные на ФЭК показатели оптической плотности умножают на коэффициент-множитель и получают искомую концентрацию спермиев в млрд/мл.

Электронные счетчики частиц позволяют наиболее точно определить число спермиев в эякуляте. В этих приборах разбавленную пробу спермы пропускают через капилляр такого диаметра, чтобы только один спермий мог одновременно пройти между двумя электродами; это прохождение регистрируется электронным лучом и подается на монитор. Оценке по объему, подвижности, концентрации спермиев подлежит каждый эякулят. Без этих данных невозможно контролировать спермопродукцию производителей, дозировать ее по числу спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

На предприятиях и станциях искусственного осеменения прибегают и к другим методам оценки спермы, преимущественно в тех случаях, когда возникает необходимость иметь более полные сведения об эякуляте или дать заключение с состоянии половой системы производителя.

Определение густоты проводится микроскопически. Если в поле зрения микроскопа между спермиями нет промежутков, сперма считается густой(Г); если промежуток не превышает размер спермия - средняя(С), а если промежуток превышает размер спермия, такая сперма считается редкой(Р). В густой сперме барана содержится не менее 2 млрд спермиев, быка – 1 млрд. В средней у барана от 1до 2 млрд, у быка – от 400 млн до 1 млрд.