Температура и рН бражки

 

Дрожжи живут и размножаются в широких температурных пределах, но для нормальной их жизнедеятельности необходима температура 29—30°С. При очень высокой или очень низкой температуре жизнедеятельность дрожжей ослабляется или прекращается. Максимальная температура для развития дрожжей 38°С, минимальная —5°С; при температуре 50°С дрожжи погибают.

 

Оптимальные температуры для развития и проявления максимальной бродильной активности не всегда совпадают. Дрожжи, выращенные при температуре, например, 17—22°С, имеют большую бродильную энергию. Сбраживание мелассного сусла при температурах выше 30°С отрицательно отражается на выходе и качестве дрожжей, выделяемых из зрелой бражки и используемых в качестве хлебопекарных. Ферментативная активность, подъемная сила и стойкость таких дрожжей при хранении понижаются, поэтому рекомендуется следующий температурный режим выращивания дрожжей и сбраживания мелассного сусла: в дрожжегенераторах 28—29°С, в двух головных бродильных аппаратах 30—31°С и в концевых аппаратах 28—29°С. Сусло из крахмалсодержащего сырья сбраживают при температуре 28—32°С.

 

При повышении температуры дикие дрожжи и бактерии размножаются значительно быстрее сахаромицетов. Если при температуре 32°С коэффициент размножения диких дрожжей в 2—3 раза больше коэффициента размножения сахаромицетов, то при 38°С — уже в 6—8 раз больше.

 

Ускоренное развитие бактерий приводит к повышению кислотности бражки. В обоих случаях уменьшается выход спирта.

 

На жизнедеятельность дрожжей значительно влияет активная кислотность среды. Водородные ионы изменяют электрический заряд коллоидов плазменной оболочки

 

25

 

клеток и в зависимости от концентрации могут увеличивать или уменьшать проницаемость плазменной оболочки дрожжевой клетки для отдельных веществ и ионов. От величины рН зависят скорость поступления питательных веществ в дрожжевую клетку, активность ферментов, образование витаминов. При изменении рН среды изменяется и направление самого брожения. Если рН бражки сдвигается в щелочную сторону, то увеличивается образование глицерина.

 

Дрожжи сохраняют жизнеспособность в пределах рН среды от 2 до 8. Для их выращивания оптимальным является рН 4,8—5.

 

При рН ниже 4,2 дрожжи продолжают развиваться, тогда как развитие молочнокислых бактерий прекращается. Это свойство дрожжей используют для подавления развития бактерий в инфицированной среде, которую подкисляют до рН 3,8 — 4 и выдерживают определенное время.

 

Потребность дрожжей в питательных веществах

 

О потребности дрожжей в питательных веществах судят по их химическому составу, который зависит от питательной среды, условий культивирования дрожжей и их физиологических особенностей. Средний элементарный состав дрожжевых клеток (в %): углерод 47, водород 6,5, кислород 31, азот 7,5—10, фосфор 1,6—3,5. Содержание других элементов незначительно: кальция 0,3—0,8%, калия 1,5—2,5, магния 0,1—0,4, натрия 0,06—0,2, серы 0,2%. В дрожжах найдены микроэлементы (в мг/кг): железо

 

90—350, медь 20—135, цинк 100—160, молибден 15—65.

 

Дрожжи в отпрессованном виде содержат 68—76% воды и 32 — 24% сухого вещества. Внутриклеточной влаги в зависимости от со стояния коллоидов дрожжевой клетки содержится 46—53% и межклеточной 22-27%. При изменении общей влажности дрожжей меняется соотношение между количеством внутриклеточной и межклеточной влаги. Удаление 85% воды из дрожжей при температуре не выше 50°С почти не влияет на их жизнеспособность.

 

Сухие вещества дрожжей включают 23—28% органических веществ и 5—7% золы. Органические вещества состоят из 13—14% белка, 6—8% гликогена, 1,8—2% целлюлозы и 0,5—2% жира.

 

Белок. Дрожжи содержат в среднем50% «сырого»белка в пересчете на сухиевещества и около 45% истинного белка. В состав сырого белка входят все соединения азота, к которым относятся производные нуклеиновых кислот — пуриновые и пиримидиновые основания, азот свободных аминокислот.

 

Гликоген. При отсутствии питательных веществ в среде гликоген дрожжевойклетки превращается в спирт и диоксид углерода.

 

Трегалоза. Наряду с гликогеном содержится трегалоза—очень мобильныйрезервный углевод, обусловливающий стойкость хлебопекарных дрожжей. Содержание трегалозы возрастает с уменьшением азота и при рН ниже 4,5.

 

Жир. В состав жира входят в основном олеиновая, линолиновая и пальмитиновая кислоты. Он содержит 30—40% фосфатидов.

 

Зола. Зола состоит из следующих основных окислов(в%):Р₂О₅—25—60,К₂О—

23—40, СаО — 1—8, МgО — 4—6, Nа₂О — 0,5—2, SО₃ — 0,5—6, 5Ю₂ — 1—2, Ре₂О₃ —

0,05—0,7.

 

Фосфор. Фосфор содержится преимущественно в виде органических инеорганических орто-, пиро- и метафосфатов. Они входят в состав молекул нуклеиновых кислот, фосфолипидов и коферментов типа аденозинфосфата и тиамина. Так, ядерное вещество клетки (нуклеопротеиды) содержит фосфор в видеортофосфата. В виде ортофосфата фосфор входит также в состав флавиновых ферментов; в виде пирофосфата

 

26

 

— во многие коферменты (кодегидразы Кох и Коц, карбоксилазы), В виде различных соединений фосфор принимает важное участие в энергетических процессах клетки.

 

Сера. Сера входит в состав очень важных соединений—аминокислот(цистеин,цистин, метионин и глютатион) и витаминов (биотин, аневрин). В ферментах сера находится в виде сульфидных и тиоловых групп.

 

Железо. Железо содержится в цитохромах,цитохром-оксидазе,пероксидазе,каталазе и других ферментах, участвующих в процессе дыхания. Оно участвует в работе других ферментов (зимогеназа, пирофосфатаза).

 

Магний. Магний активирует действие многих фосфатаз и энолазы.Ионы магниявлияют на сохранение активности ферментов при нагревании. Магний и марганец ускоряют потребление дрожжами глюкозы. Влияние магния тем сильнее, чем ниже концентрация глюкозы в среде. Питательные среды должны содержать 0,02-0,05% магния в виде сульфата. Процессы брожения регулируются изменением концентрации ионов магния в результате присоединения его к органическим веществам.

 

Калий. Калий необходим не только как питательный элемент,но и как стимуляторразмножения дрожжей. Стимулирующее действие объясняется его существенной ролью в окислительном фосфорилпровании и в процессах гликолиза. Движение неорганического фосфора внутрь клетки специфично стимулируется калием. Калий активирует дрожжевую альдолазу, необходим для действия фермента пируваткарбоксилазы и влияет, так же как азот и сера, на липидный обмен дрожжевых клеток.

 

Кальций. Кальций играет роль активатора в микробной клетке и обнаруживается вней как в свободной форме, так и в связанной с протеинами, углеводами и липидами. Ионы Са²+ могут связываться с АТФ наряду с Мg²+ и Мn2+. Кальций является кофактором транскетолазы хлебопекарных дрожжей и ингибитором некоторых ферментов, например пирофосфатазы, энолазы и адено-зинтрифосфатазы. Повышенное содержание солей кальция угнетает размножение дрожжей, снижает накопление в них гликогена и повышает содержание стеринов. Так, при содержании Са²+ до 40 мг на 1 л среды стимулируется размножение дрожжей, при большем оно угнетается.

 

Микроэлементы. Микроэлементы также имеют важное значение для размножения ижизнедеятельности дрожжей, входя в состав ферментов, витаминов и других соединений, участвующих в их синтезе. Они влияют на скорость и характер различных биохимических процессов. Например, кобальт стимулирует размножение дрожжей, повышает содержание в клетках азотистых веществ небелковой природы, прежде всего ДНК, РНК и свободных аминокислот. Он стимулирует также синтез витаминов — рибофлавина и аскорбиновой кислоты. Стимулирующее действие микроэлементов объясняется тем, что они образуют с ферментами металлорганические и внутрикомплексные соединения. Получаемый эффект зависит от прочности связи фермента с молекулой субстрата или активации субстрата в промежуточном активном комплексе.

 

Витамины и другие факторы роста дрожжей. Для нормального развития испиртового брожения дрожжи нуждаются в витаминах, которые являются кофакторами многих ферментов. Дрожжи (сахаромицеты) в большей или меньшей мере могут синтезировать все витамины, за исключением биотина, который должен обязательно содержаться в питательной среде.

 

Ненасыщенные жирные кислоты с 18 атомами углерода, особенно олеиновая, также являются важными ростовыми факторами. Стимулирующее влияние олеиновой кислоты

 

 

27

 

наблюдается только при малой ее концентрации, не превышающей 0,5 мг/мл. При увеличении концентрации рост дрожжей намного замедляется.

 

Источники питания

 

Различают экзогенное и эндогенное питание дрожжей. При экзогенном питании питательные вещества поступают в дрожжевую клетку из внешней среды, при эндогенном дрожжи используют (в основном при голодании) свои резервные вещества: гликоген, трегалозу, липиды, азотистые соединения.

 

Углеродное питание. Дрожжи(Sacch. cereviesiae)используют углерод из различныхорганических соединений: глюкозы, маннозы, галактозы, фруктозы (D-формы). Пентозы Sacch. cereviesiae не ассимилирует. В отсутствие гексоз источником углерода для дрожжей могут служить также глицерин, маннит, этиловый и другие спирты, органические кислоты (молочная, уксусная, яблочная, лимонная).

 

Следует учитывать полиауксию — последовательность потребления различных источников углерода дрожжевой клеткой. При периодическом культивировании в первую очередь потребляются глюкоза и фруктоза. Последовательность усвоения жирных кислот зависит от расы применяемых дрожжей и состава этих кислот. Например, уксусная кислота препятствует потреблению молочной, а молочная — гликолевой. Уксусная кислота и глюкоза усваиваются одновременно. Как правило, в первую очередь усваивается из смеси тот источник углерода, который обеспечивает большую скорость роста дрожжей.

 

При непрерывном культивировании дрожжей с увеличением скорости разбавления среды в ней остается больше углеродного компонента, который усваивается последним.

 

Различные виды дрожжей неодинаково относятся к ассимиляции одних и тех же веществ. Например, дикие дрожжи Cand. natalensis, Cand. parapsilosis хорошо усваивают галактозу, а Cand. clausseni совсем не усваивают ее. Дрожжи Sacch. cereviesiae начинают сбраживать галактозу только со вторых суток.

 

Дисахариды, из которых спиртовые дрожжи усваивают мальтозу и сахарозу, предварительно подвергаются гидролизу соответствующими ферментами дрожжей до моносахаридов. При переходе дрожжей от анаэробных условий к аэробным ослабляется их способность сбраживать глюкозу и мальтозу, а сахаразная активность повышается в 2,5 раза. Дрожжи потребляют мальтозу только при отсутствии в среде фруктозы и глюкозы. Мальтоза сбраживается почти полностью в стационарную фазу роста дрожжей.

 

Органические кислоты имеют важное значение в метаболизме углерода, энергетическом обмене микроорганизмов, синтетических и диссимиляционных процессах. Использование кислот жирного ряда в качестве источника углерода зависит от вида и расы дрожжей, концентрации кислоты, длины ее углеродной цепи и степени электролитической диссоциации. Хорошими субстратами служат кислоты с длиной углеродной цепи от С₂ до С₄ (уксусная, пировиноградная, молочная, масляная и др.) при сравнительно низкой концентрации. Калийные соли кислот, содержащих в молекуле от 2 до 5 атомов углерода, стимулируют рост дрожжей в 1,4—3,3 раза по сравнению с соответствующими кислотами.

 

Жирные кислоты со средней длиной углеродной цепи (от С₆ до С₁₀) в меньшей мере потребляются дрожжами и при очень низких концентрациях в среде (0,02—0,05%). Более высокие концентрации их подавляют развитие дрожжей. Жирные кислоты с 12— 17 атомами углерода в молекуле потребляются избирательно в зависимости от рода и вида дрожжей.

 

28

 

Любой из промежуточных продуктов цикла Кребса (пировиноградная, лимонная, янтарная, фумаровая, яблочная кислоты) дрожжи могут использовать в качестве единственного источника углерода.

 

Азотное питание. Дрожжи способны синтезировать все аминокислоты,входящие всостав их белка, непосредственно из неорганических азотистых соединений при использовании в качестве источника углерода органических соединений — промежуточных продуктов распада углеводов, которые образуются при дыхании и брожении.

 

Дрожжи Sacch. cereviesiae усваивают лишь две формы азота: аммиачный и органических веществ. Они эффективно используют азот сульфата и фосфата аммония, мочевины, аммиачных солей уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот. В присутствии сбраживаемых Сахаров аммиачные соли являются для дрожжей источником лишь азота; однако при потреблении его освобождаются кислоты, изменяющие рН среды. Аммиачный азот усваивается дрожжами лучше, чем азот многих аминокислот.

 

Аминокислоты являются одновременно источником азота и углерода, причем последний усваивается из кетокислот, образующихся в результате отщепления аминогрупп. Возможна

 

и непосредственная ассимиляция аминокислот из питательной среды, содержащей их полный набор и какой-либо сбраживаемый сахар. Вследствие этого снижается расход сахара среды на питание дрожжей и несколько увеличивается выход спирта при брожении.

 

Ассимиляция аминокислот обеспечивает синтез белка, в том числе и ферментов, активирует некоторые уже имеющиеся в клетке ферменты, ускоряет процесс почкования дрожжевых клеток.

 

Для потребления органического азота (аминокислот, амидов) многим дрожжам необходимы витамины (биотип, пантотеновая кислота, тиамин, пиридоксин и др.). Такие азотистые соединения, как белки, бетаин, холин, пурины и амины в виде этиламина, пропил- и бутиламина, дрожжи не усваивают. Пептиды занимают среднее положение между аминокислотами и белками. Потребление пептидов снижается с повышением их сложности. Присутствие некоторого количества пептидов в среде наряду с другими формами азота способствует потреблению аминокислот.

 

На образование 10 млрд. дрожжевых клеток расход азота в условиях анаэробиоза составляет 66—77 мг, в условиях аэробиоза 37—53 мг. По содержанию азота в дрожжах судят об условиях их культивирования и физиологическом состоянии. Содержание азота в дрожжах кроме аэрации зависит от состава среды, количества дополнительно вводимых питательных веществ и от расы дрожжей. Общего азота в дрожжах спиртовых заводов содержится 7—10% (иногда до 12%) на сухое вещество.

 

Фосфорное питание. В анаэробных условиях дрожжи усваивают фосфор главнымобразом в начальный период брожения, когда потребление его составляет 80—90% от максимального содержания в дрожжах. Молодые, энергично размножающиеся дрожжевые клетки богаче фосфором по сравнению с непочкующимися старыми. Например, после 6 часов брожения дрожжи содержат 2,15% фосфора на сухое вещество, к концу брожения — только 1%.

 

В сусле из крахмалистого сырья содержится достаточное количество усваиваемых дрожжами фосфорсодержащих соединений, в мелассном сусле их недостаточно, и приходится добавлять ортофосфорную кислоту.

 

Скорость роста дрожжей зависит от разности осмотического давления в клетке и в сусле. Чем она больше, тем быстрее размножаются дрожжи. Поэтому более активное

 

 

29

 

физиологическое состояние дрожжей наблюдается при сбраживании мелассы по двухпоточному способу.

 

При обработке спиртовых дрожжей ультразвуком в несколько раз возрастает активность инвертазы, в некоторых случаях стимулируется их рост. Воздействием на хлебопекарные дрожжи ультразвуком частотой 425 кГц в течение 1 ч повышают бродильную энергию и подъемную силу на 15—18%; при частоте 380 и 740 кГц увеличивается содержание эргостерина на 45—60%.

 

Под влиянием Y-лучей у винных дрожжей повышается бродильная, у хлебопекарных — мальтазная активность. Если дрожжи облучать ультрафиолетовымиУФ-лучами, то они теряют способность синтезировать лейцин, изолейцин и валин. Таким образом, были получены мутанты, не образующие изоамилового и изобутилового спирта. При обработке хлебопекарных дрожжей УФ-лучами и этиленамином селекционированы мутанты, превышающие в 2—5 раз контрольные дрожжи по мальтазной активности.

 

Спирты, эфиры и слабые растворы щелочей растворяют липоидные вещества клеток дрожжей. Спирты даже в небольших концентрациях (3—4%) тормозят почкование дрожжей. Однако в непрерывном потоке сбраживаемой среды дрожжи способны размножаться при относительно высокой концентрации спирта (7— 8 об. %) и продолжать сбраживать сахара до концентрации спирта 10—12 об. %. Размножение дрожжей при непрерывном брожении зависит главным образом от содержания питательных веществ, а не от содержания спирта в среде.

 

Формалин, кислоты и соли тяжелых металлов относятся к плазматическим ядам. Небольшое количество формалина (0,09%) нарушает нормальную жизнь и - деятельность дрожжей, а доза формалина 0,001% тормозит почкование дрожжевых клеток. Обычно дозы веществ, снижающие бродильную энергию дрожжей, значительно выше доз, задерживающих почкование.

 

Сернистая, азотистая и фтористо-водородная кислоты и их соли в очень малых концентрациях препятствуют нормальному росту дрожжей: диоксид серы п концентрации 0,0025%, нитриты — 0,0005%. При содержании в мелассе 0,02% диоксида серы качество дрожжей значительно ухудшается — они быстро темнеют, понижаются их подъемная сила и стойкость при хранении.

 

В растворах серной кислоты концентрацией 0,35—0,6% через 15 мин все клетки дрожжей сохраняют жизнеспособность; через 24 ч насчитывается лишь 2% мертвых клеток. Молочнокислые бактерии в 0,15%-ном растворе серной кислоты уже через 2 часа погибают, в 0,5%-ном растворе в течение такого же времени погибают все бактерии. Дикие дрожжи могут переносить воздействие 1,3%-коп. серной кислоты в течение 2 часов.

 

Свободные органические кислоты оказывают большее ингибирующее действие на дрожжи, чем их соли. Летучие органические кислоты даже в незначительных концентрациях подавляют размножение и ускоряют отмирание дрожжевых клеток. Наиболее сильными ингибиторами для дрожжей являются масляная и капроновая кислоты. Особенно чувствительны дрожжи к летучим органическим кислотам при снижении рН среды до 4. При этом через одни сутки в дрожжевой популяции наблюдается большое количество плазмолизированных клеток и почек.

 

При большом засеве дрожжей (120—150 млн. клеток на 1 мл) и при рН бражки 5,1 дрожжи расы В имели коэффициент размножения в контроле 2,1, а при содержании 0,02% масляной кислоты — 1,2; при содержании 0,02% капроновой кислоты — 1,15. Количество мертвых клеток дрожжей рас В и Я составляло 21 — 52%. В присутствии

 

30

 

пропионовой кислоты коэффициент размножения дрожжей рас В и Я в 1,5, а количество мертвых клеток — в 2 раза меньше, чем в контроле.

 

Муравьиная кислота снижает коэффициент размножения дрожжей, не вызывая отмирания клеток. Сравнительно слабым ингибитором для дрожжей является уксусная кислота.

 

Снижение выхода спирта при сбраживании синтетической среды Ридер с 13% сахарозы дрожжами расы В и Я наблюдается при следующих концентрациях летучих органических кислот в сбраживаемой среде (в масляной 0,045, капроновой 0,055, муравьиной 0,09, пропионовой 0,12 и уксусной 0,45. В этих же условиях не снижается спиртообразование у дрожжей рас Г-176 и Г-202. Указанным концентрациям кислот в 22%-ной мелассной рассиропке соответствует содержание их в мелассе (в %): масляной 0,2, капроновой 0,5 и уксусной 2,0. Наиболее часто в мелассе органических кислот значительно меньше, лишь в некоторых случаях содержание муравьиной и пропионовой кислот близко к концентрациям, при которых снижается выход спирта.

 

В присутствии масляной и капроновой кислот процесс образования высших спиртов

в значительной мере блокируется независимо от расы дрожжей.

 

Некоторые тяжелые металлы в весьма малых концентрациях убивают дрожжевые клетки (серебро—0,000001%, медь — 0,005%), а в концентрациях, не поддающихся определению химическим анализом, тормозят рост дрожжей. Бактерицидное действие тяжелых металлов зависит от состава среды, ее кислотности, температуры и плотности дрожжевой популяции. Например, соли меди в кислых средах более ядовиты, соли серебра проявляют более сильное бактерицидное действие в виде аммиачных растворов.

 

Присутствие фурфурола в сбраживаемой среде уменьшает количество почкующихся клеток и их размер. Даже незначительное содержание фурфурола снижает мальтазную и зимазную активность выделенных из мелассной бражки дрожжей.

 

Сульфонол в небольших концентрациях (70—100 г на 1 тонну мелассы) не влияет на жизнедеятельность дрожжей и подавляет молочнокислую микрофлору. Хлор, хлорная известь, марганцовокислый калий, сильно окисляя органические вещества, разрушают их.

 

В бражках с повышенным содержанием ионов Са, Мg, Fе у дрожжевых клеток теряется водная оболочка, в связи с чем уменьшаются ионная сфера и электрический заряд на поверхности клеток и создаются условия для агглютинации дрожжей.

 

Спиртовые расы дрожжей имеют отрицательный электрокинетический потенциал — от —7 до —13 мВ, вследствие чего они адсорбируют на своей поверхности меланоидины, которые имеют положительный потенциал. С понижением рН среды электрокинетический потенциал меланоидинов возрастает, в связи с чем увеличивается степень адсорбции их на дрожжевых клетках. Меланоидины придают дрожжам темный цвет, способствуют отмиранию дрожжевых клеток и, следовательно, снижению их ферментативной активности, в частности активности инвертазы и каталазы. При содержании в сбраживаемой среде меланоидинов от 0,005 до 0,3 г на 100 мл через 24 ч популяция дрожжей уменьшается в 1,3—2 раза. Следует помнить, что меланоидины образуются в процессе разваривания крахмалистого сырья.

 

Десорбция красящих веществ с поверхности дрожжевой клетки проходит интенсивно при рН промывной воды выше 9. При рН около 3 красящие вещества не десорбируются.

 

Многие ферменты дрожжей активируются в присутствии незначительных количеств сульфгидрильных соединений, содержащих SH-группы, таких, как цистеин, глютатион. Эти соединения легко превращаются одно в другое, имеют важное значение в активировании и регулировании действия многих окислительно-восстановительных и

 

31

 

гидролитических ферментов, определяющих жизнедеятельность и обменные процессы микроорганизмов.