Серологические реакции. Группы

1. Серологические реакции и их практическое применение

Серологические реакции – это реакции, протекающие между антигеном и антителом «in vitro» в электролитной среде. Серологические реакции и спользуют в диагностике инфекционных заболеваний, так как они позволяют обнаружить наличие антител (в сыворотке крови пациента) к антигенам возбудителя, антигенов возбудителя в исследуемом материале, а также определить антигенную структуру микроорганизма (то есть идентифицировать возбудителя). Для постановки серологических реакций, направленных на выявление антител к возбудителю, необходимы диагностические препараты «диагностикумы» – препараты, содержащие антигены определенного микроорганизма

Все серологические реакции условно можно разделить на три группы:

1. Прямые, при которых образующиеся комплексы антиген-антитело видны невооруженным глазом. К ним относят реакции агглютинации (РА) и реакции преципитации (РП).

2. Опосредованные (не прямые), в таких реакциях образование комплексов антиген-антитело определяют с помощью эритроцитов. Примером такой реакции является реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

3. Реакции, в которых для обнаружения комплексов антиген-антитело используют меченые антитела (антигены). В качестве метки могут выступать флуоресцентные красители, ферменты

2.Реакция агглютинации, ее разновидности. Цель и техника постановки.

Реакция агглютинации протекает, когда антиген находится в корпускулярном состоянии. Реакция протекает в две фазы. В первую фазу (специфическую) образуется комплекс антиген-антитело, во вторую фазу (неспецифическую) этот комплекс выпадает в осадок – агглютинат.

В зависимости от антигена, участвующего в реакции, характер агглютината различается, так, О-антигены - обусловливают образование мелкозернистого осадка, Н-антигены – хлопьевидного, а К-антигены – тяжистого.

Существуют два варианта постановки РА: 1. Пластинчатый (на предметном стекле), носит качественный характер, используют для определения антигенов исследуемого микроорганизма. Результат реакции оценивают по интенсивности агглютинации в «+». 2. Пробирочный (развернутый), применяют для определения количества антител в сыворотке больного. Сыворотку больного последовательно разводят в ряде пробирок. Последнее разведение сыворотки, при котором определяется четкая агглютинация, соответствует титру антител.

Методика учета пробирочной реакции агглютинации Сначала определяют титр антител на первой неделе заболевания. Для этого каждую пробирку с разведениями сыворотки пациента сравнивают с контролем диагностикума (жидкость в пробирке должна быть мутной) и контролем сыворотки (жидкость в пробирке должна быть прозрачной). Агглютинацию учитывают по наличию осадка. Титром антител считают последнее разведение сыворотки, где обнаружена агглютинация. Затем определяют титр антител на второй неделе заболевания и сравнивают титры. Увеличение титра не менее чем в четыре раза указывает на наличие заболевания у пациента.

Методика постановки реакции агглютинации на стекле На предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и помещают в нее неизвестную культуру, размешивают, затем добавляют каплю поливалентной ОВ-коли сыворотки. О наличии агглютинации свидетельствует появление зерен или хлопьев. Интенсивность реакции оценивают в «+» и дают заключение о принадлежности возбудителя к виду E. coli. По той же схеме проводят реакцию с типовыми сыворотками и определяют принадлежность к серотипу.

3. Получение и применение диагностикумов и агглютинирующих сывороток.

 

Диагностикумы представляют собой взвесь цельных убитых микроорганизмов или их антигенных фракций, которые получают путем дезинтеграции (разрушения) микробной клетки. Дезинтеграцию осуществляют разными способами (ультразвуковым, механическим, с помощью детергентов и др.), после чего выделяют капсульные, жгутиковые или соматические антигенные фракции. Применение

 

Агглютинирующую сыворотку получают гипериммунизацией кроликов взвесью бактерий. В сыворотке определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то макси-мальное разведение ее, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом. Агглютинирующие неадсорбированные сыворотки применяются при идентифи-кации бактерий сначала в ориентировочной реакции агглютинации на стекле, далее в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

4. Реакция непрямой гемагглютинации. Получение и применение эритроцитарных диагностикумов.

 

Реакция непрямой гемагглютинации – реакция, позволяющая обнаружить антитела (антигены) с помощью антигенов (антител), адсорбированных на поверхности эритроцитов (такие препараты называют эритроцитарными диагностикумами). При наличии специфичных антител происходит их связывание с антигенами, адсорбированными на поверхности эритроцитов. Результатом такого взаимодействия является агглютинация эритроцитов, она хорошо визуализируется в виде осадка с неровными фестончатыми краями («зонтик»), об отсутствии агглютинации говорит наличие осадка с четким ровным краем («диск» или «пуговка»)

Эритроцитарные диагностикумы получают путем адсорбции на поверхности отмытых эритроцитов барана антигенов микроорганизмов или вирусов.

 

Применение Сущность указанной реакции заключается в том, что эритроциты животных после адсорбции на их поверхности антигенов различной природы приобретают новую серологическую специфичность, вследствие чего могут агглютинироваться в присутствии специфических антител. Эта реакция испытана при диагностике ряда бактериальных и вирусных инфекций, в том числе и при бруцеллезе.

Методика учета реакции непрямой гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом Определяют титр антител на первой и второй неделях заболевания по последнему разведению сыворотки, в котором имеется осадок эритроцитов «зонтик». Сравнивают титры между собой, отмечая увеличение, делают заключение о наличии заболевания, если титр увеличился не менее чем в четыре раза.

 

5. Реакция преципитации. Цель и техника постановки. Реакция преципитации в геле.

Реакция преципитации (РП) протекает, когда антиген находится в мелкодисперсном состоянии. Механизм РП заключается в формировании и осаждении комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом (от лат. praecipito – осаждать). Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др

Реакция преципитации в геле: 1% осветленный агар разливают в чашки Петри или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации.

Методика учета реакции преципитации в геле. Определить наличие линий преципитации между кружком фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической сывороткой, и колониями возбудителей дифтерии (контрольным, токсигенным и исследуемыми).

6.ИФА.

иммуноферментный анализ

это метод лабораторной диагностики, основанный на реакции «антиген-антитело», который позволяет выявить вещества белковой природы.

ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики сальмонеллеза, микоплазмозов и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях

Твердофазный неконкурентный вариант - на 1м этапе проводят взаимодействие антиген-антитело, на 2-м образовавшийся иммунный комплекс обрабатывают антииммунноглобулиновой сывороткой, меченной ферментом. Проявляет реа-ию, добавляя субстрат для фермента, а затем краситель хромаген, при положит-ой реак-ии наблюд-ся измен-е цвета раст-ра

.Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген(1) и меченый ферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе. для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

7.РИФ

Реакция иммунофлюоресценции - экспресс диагностика. С его помочью выяаляют микробные антигены и антитела. Прямой метод РИФ - иммунная реа-ия взаим-ия антигена с антителами, меченными флюорохромами - вещми,дающими вторич. эмиссию в видимом спектре при облучении УФ-лучами. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа.Непрямой метод РИФ - первый этап: антигены взаимод-ют с соответ-ми антителами, образуя иммунный комплекс. На втором образовавшиеся иммунные комплексы проявляют с помощью антииммунноглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромами, Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа.