Графическое представление результатов ингибирования

Все типы ингибирования, которые были рассмотрены в разделах 1.4.1 – 1.4.3, являются примерами линейного ингибирования. Это название предложено в связи с тем, что для всех рассмотренных типов ингибирования между величинами 1 / υ_m, _каж и K_m, _каж / υ_m, _каж и концентрацией ингибитора существуют простые линейные зависимости. Линейное ингибирование называют иногда также полным ингибированием, поскольку при достаточно больших концентрациях ингибитора скорость ферментативной реакции стремится к нулю. Свойства линейных ингибиторов представлены в таблице 1.1.

Таблица 1.1.

Свойства линейных ингибиторов

Тип ингибирования	υm, каж	υm, каж / Km, каж	Km, каж
Конкурентное	υm	υm / Km 1 + [I] / Кi	Km ∙ (1 + [I] / Кi)
Смешанное	υm 1 + [I] / Кi'	υm / Km 1 + [I] / Кi	Km ∙ (1 + [I] / Кi) 1 + [I] / Кi'
Бесконкурентное	υm 1 + [I] / Кi'	υm / Km	Km 1 + [I] / Кi'

Для установления типа ингибирования можно использовать любой из графиков (см. рис. 1.4. – 1.6.). Например, если построены зависимости [S] / υ_O от [S] при различных значениях [I], то при наличии конкурентной составляющей в эффекте ингибирования изменение величины [I] приводит к изменению величины отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат (K_m, _каж / υ_m, _каж), а при наличии бесконкурентной составляющей – к изменению наклона (1 / υ_m, _каж). С другой стороны, если построены прямые, отображающие зависимость υ_m, _каж от K_m, _каж, то смещение точки пересечения характеризует тип ингибирования. При этом для конкурентного ингибирования точка пересечения смещается вправо, для бесконкурентного она смещается по направлению к началу координат, а для смешанного ингибирования характер смещения точки пересечения промежуточный. Все описанные графики представлены на рисунке 1.7.

Рис.1.7.Графики, показывающие смещение точки пересечения прямых линий, построенных в координатах K_m, _каж - υ_m, _каж для различных типов ингибирования.

Для определения действительных значений К_i и К_i' требуются графики другого вида. Простейший подход состоит в определении кажущихся кинетических констант при нескольких значениях [I] и построении графиков зависимости K_m, _каж / υ_m, _каж и 1 / υ_m, _каж от [I]. В каждом случае соответствующая зависимость является линейной, причем отрезок, отсекаемый на оси [I], равен − К_i для зависимости K_m, _каж / υ_m, _каж от [I] и − К_i' для зависимости 1 / υ_m, _каж от [I]. Некоторые полагают, что более точно можно определить величину К_i путем построения графика зависимости от [I] величины K_m, _каж, а не отношения K_m, _каж / υ_m, _каж. Это неправильно по следующим причинам:

- зависимость K_m, _каж от [I] является линейной только в случае конкурентного ингибирования; если ингибирование смешанное, то указанная зависимость отклоняется от линейности;

- зависимость K_m, _каж от [I] является менее точной (даже в случае конкурентного ингибирования), поскольку величину K_m, _каж никогда нельзя определять с такой же точностью, как и величину K_m, _каж / υ_m, _каж.

Другой метод определения К_i предложен Диксоном. Если полное уравнение для смешанного ингибирования

υ_m ∙ [S]

υ_O = ——————————————— (1.35)

K_m ∙ (1 + [I] / К_i) + [S] ∙ (1 + [I] / К_i')

представить в обратной форме, то мы получим соотношение

1 (K_m + [S]) (K_m / К_i + [S] / К_i') ∙ [I]

—— = ————— + ——————————. (1.36)

υ_O υ_m ∙ [S] υ_m ∙ [S]

Рис. 1.8. Определение константы К_i из графиков зависимости 1 / υ_O от [I], построенных при различных значениях [S] для различных типов ингибирования.

Зависимость 1 / υ_O от [I] графически изображается прямой. Если построены две подобные зависимости при различных значениях [S], то абсциссу точки пересечения можно найти, приняв два выражения для 1 / υ_O. Прямые линии пересекаются в точке, в которой [I] = − К_i. Этот метод позволяет найти К_i для любого линейного типа ингибирования. В случае бесконкурентного типа ингибирования константа К_i равна бесконечности, и поэтому зависимость 1 / υ_O от [I] представляет собой серию параллельных прямых линий. Графики зависимости 1 / υ_O от [I] представлены на рисунке 1.8.

График Диксона не позволяет определить константу бесконкурентного ингибирования К_i'. Эту константу можно найти, построив зависимость [S] / υ_O от [I] для ряда значений [I]. В этом случае получается серия прямых линий, пересекающихся в точке с абсциссой [I] = − К_i'. Графики зависимости [S] / υ_O от [I] представлены на рисунке 1.9.

Рис. 1.9. Определение константы К_i' из графиков зависимости [S] / υ_O от [I] построенных при различных значениях [S] для различных типов ингибирования.

Поскольку чаще всего встречаются такие типы ингибирования, как конкурентное и неконкурентное, а наиболее удобный способ линеаризации кинетических уравнений – способ с использованием координат 1 / υ_O - 1 / [S] (двойные обратные координаты или график Лайнуивера - Бэрка), то необходимо в заключение рассмотреть ингибирование с использованием данных координат.

При конкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I конкурируют за один реакционный центр. Реакции в данном случае описываются следующей схемой (1.37):

где: комплекс EI не способен давать продукты реакции. Такую систему можно рассмотреть в рамках модели Михаэлиса – Ментен. В стационарном приближении для ES получим (1.27):

υ_m ∙ [S]

υ_O = —————————,

K_m ∙ (1 + [I] / К_i) + [S]

[E] ∙ [I]

где: К_i = ————.

[EI]

В координатах Лайнуивера – Бэрка находим уравнение:

1 K_m 1 1

—— = ———— ∙ (1 + [I] / К_i) ∙ —— + ——. (1.38)

υ_O υ_m [S] υ_m

Таким образом, строя зависимость 1 / υ_O от 1 / [S] при постоянной концентрации [I], получим прямую линию (рис. 1.10, а). Отличие уравнения (1.38) от (1.24) состоит в том, что тангенс угла наклона при наличии ингибитора увеличивается в (1 + [I] / К_i) раз. Точка пересечения с осью 1 / υ_O для обоих графиков совпадает. Разделив уравнение (1.9) на уравнение (1.27) получим следующее:

υ_O K_m ∙ [I]

——— = 1 + —————————. (1.39)

(υ_O)_ИНГ [S] ∙ К_i + K_m ∙ К_i

Чтобы преодолеть это конкурентное ингибирование, надо повысить концентрацию субстрата по сравнению с концентрацией ингибитора. При высокой концентрации субстрата [S] ∙ К_i >> K_m ∙ [I] и уравнение (1.39) превращается в следующее соотношение:

υ_O K_m ∙ [I]

——— ≈ 1 + —————— ≈ 1.

(υ_O)_ИНГ [S] ∙ К_i

Хорошо известный пример конкурентного ингибитора – малоновая кислота СН₂(СООН)₂ в реакции дегидрирования (1.40):

Поскольку малоновая кислота похожа по своей структуре на янтарную кислоту, она может реагировать с ферментом сукцинатдегидрогеназой, хотя при этом продукты реакции не образуются.

Рис. 1.10. Графики в координатах Лайнуивера – Бэрка: а – в присутствии конкурентного ингибитора; б – в присутствии неконкурентного ингибитора.

При неконкурентном ингибировании ингибитор обычно не связывается с активным центром фермента. Происходящие при неконкурентном ингибировании реакции можно выразить следующей схемой (1.41):

Ни EI, ни ESI не образуют продуктов реакции. Поскольку I не мешает образованию ES, неконкурентное ингибирование нельзя устранить путем повышения концентрации субстрата. Начальная скорость равна:

υ_m ∙ [S]

υ_O = ——————————————. (1.42)

(K_m + [S]) ∙ {1 + ([I] / К_i)}

График в координатах Лайнуивера – Бэрка строится по уравнению:

1 K_m 1 1

—— = ——— ∙ (1 + [I] / К_i) ∙ —— + —— ∙ (1 + [I] / К_i). (1.43)

υ_O υ_m [S] υ_m

Графическая интерпретация уравнения (1.43) представлена на рисунке 1.10, б. Разделив уравнение (1.9) на уравнение (1.42), получим:

υ_O [I]

——— = 1 + ———. (1.44)

(υ_O)_ИНГ К_i

Этот результат подтверждает предположение, что степень неконкурентного ингибирования не зависит от [S] и определяется только [I] и К_i.

Пример неконкурентного ингибирования – обратимая реакция между сульфгидрильными группами остатков цистеина с ионами тяжелых металлов (1.45):