Влияние рН ферментативную активность

Кинетика ферментативных процессов (продолжение)

Молекула каждого фермента содержит несколько кислотных и оснόвных групп. В нейтральной области рН бόльшая часть этих групп либо полностью депротонирована (аспартат и глутамат), либо полностью протонирована (аргинин и лизин). В молекуле фермента всегда имеется несколько групп со значениями рК_а в интервале от 5 до 9 (рК_а – показатель кислотной константы диссоциации). Молекула фермента непременно содержит несколько групп, состояние ионизации которых меняется при изменении рН среды. Этим объясняется то, что ферменты активны в водном растворе с определенной значением рН. За немногими исключениями (пепсин и щелочная фосфатаза), наиболее изученные ферменты активны в водном растворе при значениях рН в интервале от 5 до 9.

Для описания поведения многих ферментов при изменении рН может быть использована модель, в которой принимаются во внимание только две ионизируемые группы. Ее впервые использовал Михаэлис. В соответствии с ней фермент рассматривается как двухосновная кислота (HEH) с двумя разными кислыми группами (1.46):

Для каждой стадии ионизации на схеме указана соответствующая константа диссоциации. В равновесных условиях концентрации всех форм фермента будут связаны с [H⁺] соотношениями:

[EH⁻] = [HEH] ∙ K₁₁ / [H⁺];

[HE⁻] = [HEH] ∙ K₁₂ / [H⁺];

[E²⁻] = [HEH] ∙ K₁₁ ∙ K₂₂ / [H⁺]² = [HEH] ∙ K₁₂ ∙ K₂₁ / [H⁺]². (1.47)

Константы К₁₁ и К₂₁ характеризуют отщепление протона от одной и той же группы, К₁₁ должна быть больше К₂₁, поскольку форма HE⁻ имеет на один отрицательный заряд больше, чем форма НЕН и является менее сильной кислотой. Точно так же К₁₂ > К₂₂. Выражение для концентрации формы E²⁻ должно иметь один и тот же вид независимо от того, приходим мы к нему от НЕН через EH⁻ или через HE⁻. Поэтому два выражения для [E²⁻] в уравнении (1.47) должны быть эквивалентны друг другу, и, следовательно, K₁₁ ∙ K₂₂ = K₁₂ ∙ K₂₁.

Учитывая, что полная концентрация фермента [Е]_О равна сумме концентраций всех его форм ([HEH] + [EH⁻] + [HE⁻] + [E²⁻]), получаем:

[Е]_О

[HEH] = —————————————————, (1.48)

1 + (K₁₁ + K₁₂) / [H⁺] + (K₁₁ ∙ K₂₂) / [H⁺]²

[Е]_О ∙ К₁₁ / [H⁺]

[EH⁻] = —————————————————, (1.49)

1 + (K₁₁ + K₁₂) / [H⁺] + (K₁₁ ∙ K₂₂) / [H⁺]²

[Е]_О ∙ К₁₂ / [H⁺]

[HE⁻] = —————————————————, (1.50)

1 + (K₁₁ + K₁₂) / [H⁺] + (K₁₁ ∙ K₂₂) / [H⁺]²

[Е]_О ∙ К₁₁ ∙ K₂₂ / [H⁺]²

[E²⁻] = —————————————————. (1.51)

1 + (K₁₁ + K₁₂) / [H⁺] + (K₁₁ ∙ K₂₂) / [H⁺]²

Типичные зависимости [HEH], [EH⁻], [HE⁻], [E²⁻] от рН при произвольных значениях констант диссоциации представлены на рисунке 1.11.

Рис. 1.11. Зависимость относительных концентраций форм фермента от рН для фермента НЕН, содержащего две ионизируемые группы.

В реальном эксперименте получить подобные кривые с высокой степенью точности невозможно, поскольку трудно определить одновременно все четыре константы диссоциации. Следовательно, невозможно определить, какой вклад в данное свойство фермента дает каждая из этих форм. Поэтому необходимо рассматривать EH⁻ и HE⁻ как единую форму, концентрация которой определяется выражением (1.52):

[Е]_О

[EH⁻] + [HE⁻] = ——————————, (1.52)

1 + [H⁺] / К₁ + К₂ / [H⁺]

где: К₁ = K₁₁ + K₁₂ = ([EH⁻] + [HE⁻]) ∙ [H⁺] / [HEH],

К₂ = K₁₁ ∙ K₂₂ / (K₁₁ + K₁₂) = [E²⁻] ∙ [H⁺] / ([EH⁻] + [HE⁻]).

Константы K₁ и K₂ называют молекулярными константами диссоциации, чтобы отличить их от констант диссоциации, характеризующих ионизацию индивидуальных групп K₁₁, K₁₂, K₂₁, K₂₂. С практической точки зрения константы K₁ и K₂ имеют то преимущество, что их можно измерить, в то время как константы K₁₁, K₁₂, K₂₁, K₂₂ экспериментально определить не удается, поскольку невозможно оценить величину K₁₂/ K₁₁.