Тема 6. Физиология бактерий. Ферменты бактерий. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Ферменты бактерий и их классификация Значение изучения ферментативной активности бактерий для определения их видовой принадлежности.

2. Практическое использование бактериальных ферментов.

3. Белковый, углеводный, липидный и минеральный обмены у бактерий.

4. Пигментообразование у бактерий. Значение пигментов в жизне­деятельности бактерий и для идентификации микроорганизмов.

5. Характеристика L-форм бактерий.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Ферменты бактерий и методы их определения

Все метаболические процессы, протекающие в клетке, происходят при участии ферментов - биологических катализаторов. Они представляют собой специфические функциональные белки, третичной или четвертичной структуры, связанные с каким-либо сахаром (гликопротеины). Ферменты состоят из белковой части (апофермента) и простетической группы (кофермента), которая взаимодействует с субстратом. Микробы синтезируют разные ферменты, подразделяясь на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы. гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы (табл. 4).

Таблица 4. Классификация ферментов

Класс ферментов	Катализируемые реакции
Оксидоредуктазы	Перенос электронов (окислительно-восстановительные реакции
Трансферазы	Перенос групп между молекулами
Гидролазы	Реакции гидролиза (перенос функциональных групп на молекулу воды)
Изомеразы	Перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм
Лиазы	Удаление групп и формирование двойных связей или прибавление групп к двойным связям
Лигазы	Объдинение двух молекул с использованием энергии АТФ (реакции конденсации с образованием С-С-, С-S-, C-O-, C-N- связей

По расположению ферменты микробов делятся на экзоферменты (выделяются в окружающую среду, расщепляют макромолекулы до простых веществ, способных пройти в клетку) и эндоферменты (функционируют в микробной клетке). Выделяют ферменты конститутивные (постоянно синтезируются в клетке) и индуцибельные (синтезируются в клетке только при наличии субстрата). Каждый микроб имеет определенный набор генетически запрограммированных ферментов, который является достаточно постоянным признаком. Определение ферментов используется при идентификации бактерий.

Многие микробы вырабатывают ферменты патогенности, действуя на вещества, входящие в состав клеток и тканей организма. К ним относятся гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза и др.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом, наблюдая через 3—5 дней разжижение желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. В присутствии сероводорода полоска бумаги, пропитанная раствором ацетата свинца, чернеет. Для определения аммиака используют лакмусовую бумажку.

Важным признаком многих микроорганизмов является способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого свойства бактерий используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.) и индикаторы (например, реактив Андреде, меняющий свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5), поэтому эти среды нередко называют «пестрым» или «цветным» рядом. Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают стеклянные поплавки или используют полужидкие среды. Сбраживание лактозы в молочных средах определяют по их свертыванию или изменению цвета лакмусового индикатора, а также при пептонизации.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин (промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты). Для этого к 3 мл культуры микроорганизмов на среде Кларка добавляют 1 мл свежеприготовленного 10% спиртового раствора α-нафтола и 1 мл 20% водного раствора гидроксида калия. При наличии ацетоина СНзСНОН СОСН₃ жидкость приобретает красную окраску, что свидетельствует о бутандиоловом брожении.

Каталаза - фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода, содержат аэробы и факультативные анаэробы, но не анаэробы. Для обнаружения фермента небольшое количество исследуемой культуры эмульгируют в капле перекиси водорода, наблюдая выделение пузырьков кислорода.

Определение цитохромоксидазы (фермента, обеспечивающего перенос электронов на атом кислорода в процессе анаэробного дыхания) проводят при дифференциации энтеробактерий, применяя смесь 1% спиртового раствора β–нафтола и 1% водного раствора N-диметил-парафенилендиамина дигидрохлорида, смешанных в соотношении 2:3. На полоску фильтровальной бумаги, смоченной этим реактивом, наносят петлей культуру микроорганизмов. При наличии фермента через 2-5 мин полоска окрашивается в синий цвет.

Важным биохимическим свойством у ряда микробов является их способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для определения нитритов используют реактив Грисса, который готовят из 2 растворов: (первый - 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 30 мл ледяной уксусной кислоты, с последующим добавлением 100 мл воды; второй - 0,1 г нафтиламина, растворенного в 100 мл кипящей воды, с последующим добавлением 30 мл ледяной уксусной кислоты). Оба раствора смешивают в равных объемах, 0,1 мл реактива добавляют в культуру бактерий. Окрашивание культуры в красный цвет указывает на присутствие нитритов.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и изменению реакции среды в щелочную сторону (с pH 7,2 до 8,8, при этом среда приобретает пурпурно-красный цвет).

Идентификацию бактерий по биохимической активности проводят на дифференциально-диагностических средах Гисса («пестрый» ряд), а также используют современные диагностические тест- системы: API (Франция), Lachema (Чехия), Roshe-Tube (Германия), Vitek (США) и др. Микротест-системы (слайды) для биохимической идентификации различных микроорганизмовпредставляют собой полистироловые планшеты или панели, в лунках которых находятся сухие дифференциально-диагностическими среды для определения ферментации, ассимиляции, оксидации, деградации и гидролиза различных субстратов. Для ускорения идентификации в лунки добавляют хромогены или флюорохромы, которые могут быть выявлены химическими или флюориметрическими методами при помощи приборов. В настоящее время для этих целей созданы полуавтоматические или автоматические бактериологические анализаторы (рис. 26 - приложение). В основе работы этих приборов лежит оценка микробного роста методом периодических измерений панелей с хромогенными, флуорогенными и индикаторными биохимическими субстратами при помощи методов колориметрии, турбидиметрии и проточной цитометрии.

Для исследования крови на стерильность применяются приборы BACTEC (Becton Dickinson, США) и Bact/Alert (bioMerieux, Франция). Принцип работы обоих приборов сводится к постоянному инкубированию и как можно скорейшему автоматическому выявлению положительных образцов крови, помещенных во флакон со специальной средой, с помощью флюоресценции или колориметрии, а также контроля газообразования с применением компьютерных систем.

В основание каждого флакона введен угольный диоксид (сенсор), отделенный от кровяного бульона мембраной, полупроницаемой для СО₂, что позволяет определять количество СО₂ во флаконе по изменению цвета сенсора при увеличении концентрации СО₂ во флаконе. Кроме того, в основании ячейки для каждого флакона, находящегося на инкубации, расположен светоизлучающий и светопоглощающий диод. Также как и в Bact/Alert, в приборах BACTEC используется угольный диоксидный сенсор, расположенный в основании каждого флакона со средой. В отличие от Bact/Alert система BACTEC использует флюоресцентный механизм для определения бактериального роста. Система имеет несколько сред для работы с аэробами и анаэробами. Основным компонентом системы BACTEC MGIT 960 является пробирка MGIT с флуоресцентным индикатором роста на дне, который погашен высокими концентрациями О₂, растворенного в среде. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться при УФ облучении. Система BACTEC MGIT 960 расценивает пробирку как положительную, если количество живых микроорганизмов в ней достигло 100 000 на 1 мл среды. Прибор осуществляет непрерывный мониторинг флаконов.

Для целей идентификации микроорганизмов и выявления их чувствительности к антибактериальным препаратам разработаны полуавтоматические приборы iEMS (Labsystems, Финляндия) и MiniAPI (или его аналог ATB-Expression, bioMerieux, Франция), а также автоматические системы VITEK и VITEK2 (bioMerieux, Франция), BD Phoenix (Becton Dickinson, США), WalkAway (Dade Behrig, США). Тест-системы для определения антибиотикорезистентности представляют собой карту, размером с «кредитку», в которой находятся лунки с 20 антибиотиками в разных концентрациях (рис. 27 - приложение). Начальные этапы работы на любом полуавтоматическом бактериологическом анализаторе схожи: в первую очередь необходимо получить чистую молодую (18–24 часа) культуру возбудителя, после чего провести микроскопию и окрашивание по Граму, а также поставить ряд ориентировочных тестов.

Эта первичная информация о возбудителе определяет выбор тест-систем (панелей) для дальнейшей работы с культурой уже на приборе с использованием готовых тест-систем (панелей, стрипов и т.п. - рис. 27 - приложение), в лунках которых находятся лиофилизированные биохимические субстраты или стандартный набор антибиотиков. Эти субстраты при добавлении точного количества раствора тестируемой живой культуры вступают или не вступают в реакцию, с изменением при этом либо цвета, либо мутности, либо с образованием пузырьков воздуха после периода инкубации (4 или 18–24, иногда до 48 часов в определенных температурных и атмосферных условиях). Результаты исследования чувствительности к антибиотикам определяются по наличию роста в лунках панели и сравнению с контролем

Планшетный фотометр iEMS-reader (Labsystems, Финляндия) представляет собой 8–ми канальный полуавтоматический прибор со встроенным термостатом (14–40°С), системой съемных фильтров и встряхивателем, совместимый с компьютером, который работает в зависимости от программного обеспечения как микробиологический или иммуноферментный анализатор. Тест-системы для идентификации выпускаются в формате 96–луночных планшетов.

Другим полуавтоматическим бактериологическим анализатором является miniAPI (или его аналог ATB-Expression, bioMerieux, Франция), представляющий собой ридер со встроенным монитором, клавиатурой и денситометром для автоматического определения мутности бактериальной суспензии. Стрипы для идентификации и определения чувствительности к антибиотикам разработаны на основе API-технологии к широкому кругу микроорганизмов и химиопрепаратов.

Особое место в бактериологии занимают полностью автоматизированные системы, в которых инкубация, считывание результата и его обработка проходят без участия лаборанта. Выпускаются автоматические бактериологические анализаторы BD Phоenix (Becton Dickinson, США), VITEK и VITEK2 (bioMerieux, Франция) и WalkAway (Dade Behring, США).

Эти приборы разработаны для ускорения получения результатов идентификации и чувствительности микроорганизмов к антибиотикам путем повышения уровня автоматизации и качества работы. В некоторых приборах идентификацию грамположительных кокков можно получить через 2 часа, а грамотрицательных через 3 часа. В процесс анализа входит получение чистой молодой культуры, постановка ориентировочных тестов, микроскопия и окраска по Граму, приготовление раствора тестируемых микроорганизмов, заполнение панелей или карт для идентификации и чувствительности, постановка панелей/карт в прибор, введение данных о пациенте.

Бактериологический анализатор VITEK, управляемый компьютером со специальной программой, состоит из двух блоков - устройства для заполнения и устройство для запаивания карт, а также инкубатора и ридера. После приготовления раствора из выращенной культуры, мутность которого (т.е. количество микроорганизмов в единице жидкости) оценивается на нефелометре, входящем в состав прибора, карта заполняется автоматически при помощи вакуума, после чего карта герметически запаивается. Карты для идентификации возбудителей содержат 30 лунок с лиофилизированными биохимическими субстратами и необходимыми реагентами. Результат взаимодействия микроорганизма с реактивами фиксируется прибором и оценивается компьютерной программой. Карты для определения чувствительности к антибиотикам состоят из 45 лунок, заполненных антибиотиками различной концентрации. Время идентификации микроорганизмов (база данных прибора более 300 таксонов) и определения чувствительности к антибиотикам (более 12 вариантов карт с антибиотиками) при помощи анализатора VITEK для большинства микроорганизмов не превышает 4–6 часов.

Более совершенным является бактериологический автомат VITEK2 (bioMerieux, Франция), в котором количество ручных манипуляций на этапе подготовки и приготовления раствора микроорганизмов уменьшено по сравнению с прибором VITEK. В приборе используется флуоресцентный индикатор, а в случае ферментативных тестов используется меченый субстрат. За счет этого время анализа сокращается до 1,5 часов.

Автоматизированный бактериологический анализатор BD Phoenix обладает высокой производительностью (до 200 тестов одновременно) и создан для крупных лабораторий. Основной блок прибора состоит из инкубационного модуля на 100 мест и считывающего устройства. Прибор управляется компьютером, встроенным вместе с монитором в блок анализатора. Все анализы выполняются на специально разработанных панелях с 45 биохимическими субстратами для идентификации и специальных панелей для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Результаты учитываются по изменению цвета в процессе жизнедеятельности бактерии или наличию мутности, свидетельствующей о микробном росте, используя метод флюоресценции.

Другой системой автоматизированного бактериологического исследования является WalkAway–40, 96 (Dade Behring, США), позволяющей проводить идентификацию микроорганизмов и определение их чувствительности к антибактериальным препаратам за 2–3 часа и 4–24 часа соответственно. Тестируемый спектр включает в себя более 300 микроорганизмов. Панели имеют флуоресцентную метку.

Автоматизированная система для считывания и анализа результатов диско-диффузионного метода на плашке OSSIRIS (BIORAD, США) использует любые реагенты, в том числе российского производства.

Принцип работы прибора:

1. исследование 2х-мерного изображения чашки Петри с дисками и зонами подавления роста.

2. сопоставление диаметра зон роста со значениями NCCLS (международные рекомендации по диско-диффузионному методу).

3. определение профиля резистентности микроорганизмов с выдачей рекомендаций по использованию антибиотиков. (2)

В системе идентификации микроорганизмов Sherlock (США) применяется хроматографическая система, автоматически определяющая состав комплекса жирных кислот, входящих в клетки бактерий или грибов, а затем идентифицирующая его, сравнивая с комплексами жирных кислот известных микроорганизмов, которые хранятся в обширной базе данных (более 2000 видов аэробных и анаэробных бактерий, грибов). Это позволяет быстро, очень точно и с минимальными затратами произвести определение видовой принадлежности исследуемого микроорганизма. Состав жирных кислот клеток - очень устойчивая генетическая черта, которая сохраняется в поколениях микроорганизмов с высокой степенью достоверности. Результаты автоматизированного хроматографического анализа жирных кислот не уступают в точности ПЦР-анализу, который в настоящее время является эталоном достоверности при идентификации биологического материала. Простые мутации, или изменение генетического материала клеток в результате деятельности плазмид, не изменяют состав жирных кислот клеток микроорганизмов. Максимально снизить влияние на него окружающей среды позволяют стандартизированные условия выращивания микроорганизмов, которые описаны в методике проведения их идентификации с помощью системы MIDI Sherlock. В последнее время была создана специальная база данных Sherlock Bioterrorism Library, позволяющая быстро и точно идентифицировать несколько важнейших биологических видов особо патогенных микроорганизмов, которые могут быть использованы как средство осуществления актов биотерроризма и ведения биологической войны: Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Brucella melitensis Burkholderia cepacia Burkholderia gladioli Burkholderia mallei Burkholderia pseudomallei Francisella philomiragia Francisella tularensis Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis.

Микробиологический анализатор БиоТрак 4250 - это новейшая разработка компании SY-LAB Gerate GmbH (Австрия). Принцип действия прибора основан на регистрации относительного изменения электрического сопротивления среды, происходящего под влиянием процессов роста жизнедеятельности микроорганизмов. Этот портативный и компактный анализатор предназначен для проведения микробиологических исследований и контроля качества и сертификации продуктов питания, сырья, напитков, воды, косметических средств, контроля стерильности различных материалов и растворов. Основным преимуществом микробиологического анализатора БиоТрак 4250 является автоматическая регистрация и обработка результатов, что позволяет получать объективные результаты, сократить время исследования, уменьшить трудозатраты и значительно снизить себестоимость анализа.

Сравнительно недавно для идентификации бактерий стали использовать масс-спектроскопию. Масс-спектрометр сортирует молекулы клетки по соотношению молекулярная масса/заряд и составляет характеристические наборы значений для каждого вида и даже варианта микробов. Этот метод ограниченно годен для микробиологической диагностики, поскольку клетки разных видов микроорганизмов часто обладают очень сходными молекулами, а количество этих молекул может сильно варьировать на разных стадиях клеточного цикла.

В последние годы для видовой идентификации бактерий используются также молекулярно-генетические методы, в том числе рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, и наиболее часто - полимеразная цепная реакция - ПЦР).