Вопрос 6 (44) биотехн

Если целевой продукт является внутриклеточным, то для его извлечения из клеток приходится разрушать всю систему, поэтому возникает вопрос о целесообразности использования иммобилизации биообъекта. В этом случае, методами генетической инженерии, может быть сконструирована и введена в продуцент система транспорта целевого продукта из клетки в среду.

К системе внутриклеточного транспорта относится внутренняя часть цитоплазматической мембраны — двухслойная фосфолипидная субклеточная структура с включенными в нее разнообразными по функциям белками, мембраны митохондрий, вакуоли у растений, эндоплазматический ретикулум. Через эти структуры осуществляется транспорт веществ внутри клетки.

Процессы транспорта через клеточную оболочку связаны с секрецией конечных продуктов у микроорганизмов. Их подразделяют на пассивную диффузию, облегченную диффузию и активный транспорт.

При пассивной диффузии, т.е. в соответствии с градиентом концентрации, когда в среде концентрация выше, чем внутри клетки, в клетку проникают вода, углеводороды, молекулы кислорода, азота, водорода.

В случае облегченной диффузии необходимые клетке вещества переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз — особого класса белков, содержащихся в мембране. Переносимое вещество реагирует с пермеазой на наружной стороне мембраны и освобождается после переноса через мембрану внутри клетки. При облегченной диффузии проникающее в клетку вещество продвигается по градиенту концентрации. Затрат энергии на этот процесс не требуется, как и при пассивной диффузии.

При активном транспорте вещества в клетку, требующем затраты энергии, движение переносимого вещества может происходить против градиента концентрации. При этом концентрация накапливающегося в клетке соединения может превзойти в сотни и тысячи раз его концентрацию в среде. В такие системы входят расположенные в периплазматическом пространстве белки с высоким сродством к ряду метаболитов, принадлежащим к пептидам, аминокислотам, сахарам и др. Они препятствуют выходу в среду ряда метаболитов из цитоплазмы. С их помощью в периплазматическом пространстве накапливаются определенные питательные соединения из среды.

Самостоятельный интерес представляет выведение из клетки избыточных продуктов метаболизма, в частности защитных ферментов, антибиотиков и экзоферментов, позволяющих утилизировать находящиеся в среде полимеры. Низкомолекулярные вещества могут выводиться путем пассивной или облегченной диффузии. Однако существуют и энергозависимые системы. Особый интерес у биотехнологов, в том числе работающих в области получения рекомбинантных белков, вызывает проблема выведения из клетки белка, синтезируемого в цитоплазме, включая чужеродный белок, являющийся целевым продуктом. В данном случае биотехнолог идет по пути повторения выработанного эволюцией механизма секреции таких белков, как внеклеточные ферменты.

Когда синтезируется такого рода белок, которому предстоит пересечь цитоплазматическую мембрану и выйти из клетки в среду, то, во-первых, его синтез происходит на рибосомах, связанных с обращенной в цитоплазму поверхностью цитоплазматической мембраны, во-вторых, покидающая рибосому полипептидная цепь на своем N-терминальном конце содержит сигнальный или лидерный пептид (15—30 аминокислотных остатков). Этот дополнительный участок в полипептидной цепи временно нужен для выведения внеклеточного белка из клетки

Разумеется, проблема выведения чужеродных белков не решается однозначно и только за счет присоединения лидерной последовательности, так как существует много других факторов, влияющих на экскрецию белков.

В заключение этого краткого рассмотрения проблем транспорта веществ в клетку и из клетки обратим особое внимание на мутации, которые могут затрагивать ферментные системы транспорта, молекулы переносчиков, структурные компоненты цитоплазматической и внешней мембран, что дает биотехнологу богатый набор мутантов с самыми разнообразными изменениями физиологических и биохимических свойств.

Особенности транспортных систем у некоторых биообъектов определяют их способность воздействовать на окружающую среду в нужном для человека аспекте.

Например, ряд представителей микроорганизмов рода Pseudomonas и целенаправленно полученных от природных культур мутантов обезвреживают самые разнообразные химические соединения (кольчатые углеводороды и др.), попадание которых в окружающую среду приводит к нарушению экологии в обширных географических регионах. Причем способность вышеуказанных микроорганизмов обезвреживать загрязнения обусловлена не только набором ферментов, утилизирующих экзотические вещества, но и особенностями транспортных систем, начиная с режима осцилляции пориновых каналов внешней мембраны.

Билет 45

Вопрос 1(45)УЭФ

►По иногороднему рецепту можно отпустить настойку зверобоя и раствор левомицетина спиртовой заводского изготовления. Раствор левомицетина спиртовой, приготовленный в аптеке и этиловый спирт 70% - 50мл по иного­роднему рецепту не отпускается, т.к. согласно приказу №245 норматив потребления спирта этилового рассчитывается на 1000 экстемпоральных рецептов, а для ЛПУ- 1 пролеченный больной, 1000 посещений, 1000 анализов и т.д.

Математический расчет:

П= Н·К/1000, где

П-потребность в препарате,

Н-норматив потребления на еденицу объекта,

К-фактическое количество жителей, рецептов, анализов.

Метод прост и доступен.

► Согласно приказу №110 рецепты оформляются на бланке формы 148 -1/у-88.

Требования к оформлению рецепта

Любой рецепт, независимо от порядка оплаты лекарства и характера фар­макологического действия входящих в их состав медикаментов, должен содер­жать следующие основные (обязательные) реквизиты:

- штамп ЛПУ (с указанием наименования ЛПУ, его адреса и телефона);

- дата выписывания рецепта;

- ФИО больного и его возраст;

- ФИО врача;

- наименование (на латинском языке) и количества ЛС;

- подробный способ применения на русском или русском и националь­ном языках (запрещается ограничиваться общими указаниями «Известно», «Внутреннее»);

- подпись и личная печать врача.

Дополнительные реквизиты бланка:

- серия и номер рецепта;

- адрес и номер медицинской карты амбулаторного больного;

- печать ЛПУ «Дпя рецептов»;

Рецепт выписывается в 2-х экземплярах.

На рецептурном бланке формы № 148-1/у-88 может быть выписано толь­ко одно наименование лекарственного средства (ЛС).

► Срок действия данного рецепта 10 дней, срок хранения 3 года. ЛС, содержащие спирта этилового, подлежат ПКУ

► Нормы отпуска спирта этилового

Отпуск из аптек лекарств по рецептам врачей регламентирует приказ Минздравсоцразвития от 14.12.05 №785 «О порядке отпуска лекарственных средств». Отпуск этилового спирта производится амбулаторным больным по ре­цептам врачей. Согласно приказу №785, п.3.11. Отпуск этилового спирта про­изводится в соответствии с нормами:

- по рецептам, выписанным врачами с надписью «Для наложения ком­прессов» (с указанием необходимого разведения с водой) или «Для обработки кожи» — до 50 граммов в чистом виде;

- по рецептам, выписанным врачами на лекарственную пропись индиви­дуального изготовления, — до 50 граммов в смеси;

- по рецептам, выписанным врачами на лекарственную пропись индиви­дуального изготовления, с надписью «По специальному назначению», отдельно заверенной подписью врача и печатью ЛПУ «Для рецептов», для больных с хроническим течением болезни — до 100 граммов в смеси.

Спирт этиловый 95% подлежит предметно-количественному учету (ПКУ). Перечень ЛС, подлежащих ПКУ в аптечных организациях, предприятиях оптовой торговли и ЛПУ утвержден приказом Минздравсоцразвития России №109 от 12. 02.2007.

ПКУ ведется в Книге учета спирта этилового, пронумерованной прошнурованной, заверенной печатью и подписью руководителя. Книга заводится на 1 год. Исправления зачеркиваются и заверяются подписью материально-ответственного лица (МОЛ). На первое число каждого месяца МОЛ сверяет фактическое наличие спирта книжному. В случае обнаружения отклонений вы­являются виновные. Расхождение книжного остатка и фактического наличия спирта этилового может аргументироваться естественной убылью (ЕУ). Нормы ЕУ составляют предельный размер товарных потерь, устанавливаемый норма­тивными документами.

Вопрос 2 (45)Апт. Техн.

Изготавливают 5% раствор левомицетина на 70% спирте этиловом по правилам изготовления неводных растворов.

Для приготовления раствора по данной прописи необходимо учитывать летучесть этанола и снижение его растворяющей способности при разбавлении водой. Левомицетин помещают непосредственно в сухой отпускной флакон, затем отмеривают 50 мл 70%-ного этанола, закупоривают и взбалтывают до растворения. В случае засорения процеживают через сухой ватный тампон.

Для точного дозирования раствора с содержанием лекарственных веществ более 3 % необходимо проведение предварительных расчетов количества этанола с учетом коэффициента увеличения объема (КУО) спиртовых растворов.

Разбавление водно-спиртовых растворов проводится по объему и по массе. При этом удобно исходить из уравнения материального баланса по абсолютному спирту:

x a = p b

где x – количество крепкого спирта;

а - концентрация крепкого спирта;

р- количество спирта требуемой концентрации;

b – требуемая концентрация.

При смешивании воды и спирта наблюдается явлении контракции, заключающееся в уменьшении объема смеси против арифметической суммы исходных веществ.

Вопрос 3 (45)

5% спиртовый раствор левомицетина получают в отдельном помещении с соблюдением правил взрыво- и пожароопасности. Растворение проводят в герметически закрывающихся реакторах, без нагревания, фильтруют через друк-фильтр, так как при использовании ваку­умных фильтров происходит закипание этанола и его потери.

Аппаратурная схема

1-высы;2-вибрационное сито; 3-мерник крепкого спирта;4-мерник воды; 5- мерник разбавленного спирта; 6-реактор;7-друк-фильтр;8-аппарат для фасовки и упаковки.

При приготовлении раство­рителя необходимо учитывать явление контракции.

Технологическая схема

ВР.1.Вспомогательные работы (подготовка помещения, - оборудования, - персонала);

ВР.2. Подготовка порошка левомицетина и растворителя (взвешивание и измельчение порошка левомицетина;просеивание порошка левомицетина; приготовление растворителя спирта 70%);

ТП.3. Получение спиртового раствора левомицетина (растворение левомицетина в растворителе);

ТП.4. Фильтрование спиртового раствора левомицетина (фильтрация спиртового раствора левомицетина);

УМО.5. Фасовка и упаковка готового продукта (фасовка спиртового раствора левомицетина во флаконы; упаковка флаконов; маркировка флаконов);

Готовая продукция – на склад.

Вопрос 4(45) ф/х

Левомицетин- Laevomycetinum

. Chloramphenicol — хлорамфеникол (МНН)

D-(-)-трео-1 -п-нитрофенил-2-дихлорацетиламинопропандиол-1,3

Белый или белый со слабым желтовато-зеленоватым оттенком кристаллический порошок без запаха. Т. пл. 149-153°С. Хлорамфеникол мало растворим в воде, эфире, хлороформе, растворим в этилацетате. В этаноле хлорамфеникол легко растворим.

Удельное вращение от +18 до +21° (5%-ный раствор в этаноле). Молекула содержит асимметрические атомы углерода (*) и поэтому обладает оптической активностью. Удельное вращение является качественной характеристикой левомицетина. ФС рекомендует устанавливать величину удельного показателя поглощения при длине волны 278 нм (от 290 до 305). Фармакологичекой активностью обладает левовращающий изомер.

Реакция гидролиза в щелочной среде лежит в зснове испытания подлинности хлорамфеникола и его производных. При нагревании в течение 1-2 мин с 15%-ным раствором гидроксида натрия хлорамфеникол приобретает желтое окрашивание, переходящее в красно-оранжевое. Одновременно ощущается запах аммиака. Фильтрат после подкисления азотной кислотой дает характерную реакцию на хлориды. Это позволяет подтвердить наличие в молекуле хлорамфеникола нитрофенильного радикала, аминогруппы и ковалентно связанного атома хлора, поскольку при щелочном гидролизе образуется «основание» хлорамфеникола, переходящее в аци-форму, выделяется аммиак и натриевая соль глиоксиловой кислоты:

Левомицетин взаимодействует с сульфатом меди с образованием комплексного соединения синего цвета.

Ароматическая нитрогруппа обнаруживается по образованию азокраси-теля после восстановления ее до аминогруппы цинковой пылью в среде серной

кислоты. Одновременно отщепляется органически связанный хлор, который в виде хлорид-иона обнаруживается в растворе по реакции с нитратом серебра:

Образовавшийся 1 -п-аминофенил-2-ацетиламинопропандиол-1,3 диазотируют и превращают в азокраситель, сочетая с d-нафтолом. а-нафтиламином или другим амином или фенолом. Например, в результате азосочетания с d-нафтолом образуется азокраситель красного цвета:

Количественное определение хлорамфеникола по ФС выполняют нитритометрическим (ароматическая нитрогруппа обнаруживается по образованию азокраси-теля после восстановления ее до аминогруппы) методом после предварительного гидрирования в кислой среде цинковой пылью:

Конечную точку титрования определяют с помощью внешнего индикатора: иодкрахмальной бумаги. При титриметрическом определении (Х%) расчет проводят по формуле:

Х% = V·K·T·100/а

где: V - объем титранта, мл;

К — поправочный коэффициент;

Т- количество новокаина (г), соответствующее 1 мл 0,1 М раствора нитри­та натрия, г;

а - масса навески, г.

Хлорамфеникол хранят по списку Б. в хорошо укупоренной таре в склянках оранжевого стекла, в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре.

Хлорамфеникол — антибиотик широкого спектра действия. Его применяют для лечения брюшного тифа, паратифов, дизентерии, бруцеллеза, коклюша, пневмонии, различных инфекционных заболеваний. Он легко всасывается из желудочно-кишечного тракта, сохраняя при этом свою активность. Это позволяет использовать хлорамфеникол для назначения внутрь обычно в дозах 0,5 г 3-4 раза в сутки.