Семейство Dnmt1

Структурно-функциональное исследование генов эукариотических ДНК-метилаз началось значительно позднее аналогичных исследований у прокариот. Впервые кДНК гена DNMT1 кодирующая полноразмерный ген мышиной ДНК-метилазы, была клонирована в 1988 г. Это белок из 1620 аминокислотных остатков с молекулярной массой 190 кДа, проявляющий оптимальную метилтрансферазную активность на полуметилированной ДНК. Следует отметить значительно увеличенный размер этого фермента по сравнению с прокариотическими ферментами, обусловленный наличием на N-концевой части молекулы дополнительного участка весьма большой протяженности, составляющего две трети всей молекулы. В клетке ДНК-метилаза Dnmt1 выполняет функцию поддерживающего метилирования ДНК, и эту функцию контролирует ее N-концевой домен. N-Кониевой домен ДНК-метилазы Dnmt1 позволяет ферменту различать в ДНК неметилированные и полуметилированные СрG-последовательности и предпочтительно метилировать in vitro и in vivoэти полуметилированные сайты. Лишенный своего N-концевого домена, фермент теряет это свойство и превращается в «типичную» прокариотическую ДНК-метилазу. Однако недавно это положение пересмотрено и показано, что для активности метилазы Dnmt требуется также существенная часть N-концевого домена без первых 300 аминокислот. Предполагается, что N-концевой домен требуется для правильного формирования третичной структуры метилазы Dnmt1. По-видимому, ген Dnmt1 возник путем слияния гена прокариотической ДНК-метилазы с одним или двумя генами, кодирующими связывающиеся с ДНК белки.

ДНК-метилаза Dnmt1 содержит в своем N-концевом домене разнообразные специфические функциональные последовательности, такие как сигнал ядерной локализации (NLS), обогащенный цистеином цинксвязывающий мотив и специальную последовательность, направляющую метилазу в область репликации ДНК (рис. 1). Фермент ассоциирован с областью репликации в течение S-фазы и распределен диффузно в нуклеоплазме в клетках, находящихся вне S-фазы. Клонирована и охарактеризована также кДНК гена Dnmt1человека. Структура этой метилазы, включая N-концевой домен, близка к структуре соответствующей метилазы мыши. Метилаза Dnmt1 человека и животных является компонентом репликативного комплекса. На это указывает, в частности, нахождение фермента в комплексе с ядерным антигеном пролиферируюших клеток человека. N-Концевой регуляторный и С-концевой каталитический домены молекулы Dnmt1 связаны GК-аминокисдотными повторами. Следует отметить, что ДНК-метилаза Dnmt1 содержит в своем N-кониевом домене аминокислотные последовательности, гомологичные транскрипционному репрессору НRХ, посредством которого фермент ассоциирован in vivo с гистоновой деаиетилазой. Список некоторых белков, способных ассоциировать с эукариотическими ДНК-метилазами, представлен в таблице.

Хотя Dnmt1 предпочтительно работает на полуметилированных сайтах, этот фермент способен также метилировать необычные субстраты с различными структурными аномалиями. Мышиная ДНК-метилаза способна метилировать однонитевую ДНК, если она содержит в своей цепи m⁵С. Предполагается, что фермент распознает присутствующий в однонитевой цепи ДНК m⁵С в качестве сигнала для метилирования немодифицированных остатков цитозина в последовательностях СрG и что фермент работает на петлевых участках однонитевой цепи. Аналогичная способность модифицировать однонитевые ДНК присуща также бактериальной ДНК-метилазе Есо dam, участвующей в процессах репликации и репарации ДНК. Такую же сигнальную функцию индукции метилирования m⁵С может выполнять на полуметилированной и полностью неметилированной последовательностях СрG в дуплексных субстратах, причем скорость метилирования таких полуметилированных субстратов de novo в несколько раз выше скорости метилирования ферментом немодифицированных субстратов. Dnmt1 человека может избирательно узнавать и модифицировать полуметилированные асимметричные дуплексные субстраты, состоящие из «целевой мишени” СрG на одной цепи и спаренного с ней метилированного цитидинового остатка в комплементарной цепи. При этом соседство этого метилированного цитидина в своей цепи с гуанозином не обязательно: соседом может быть любой нуклеозид или его производное (рис. ….). На рисунке Полу метилированная дуплексная последовательность детерминирует метилирование цитозина (*С) в СрG-последовательности нижней цепи. С не обязательно должен быть спарен с гуанином верхней цепи. Асимметричный сайт узнавания заключен в рамку.

Рис….….. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз семейства Dnmt1.

Оптимальные для метилирования de novo субстраты содержат между немодифицированными динуклеотидами СрG другие последовательности длиной 13-17нуклеотидов. Важно также отметить метилирование мышиной ДНК-метилазой de novo остатков цитозина в последовательностях, отличающихся от СрG, и более выраженное проявление этой способности на однонитевой ДНК. Таким образом, не исключено, что наблюдаемый в клетках различных эукариот несимметричный тип метилирования в ДНК остатков цитозина может осуществляться уже известными ДНК-метилазами при участии специфических регуляторных факторов, модулирующих специфичность узнавания метилируемой последовательности.

Инактивация гена мышиной метилазы Dnmt1приводит к значительному (до 70%) снижению общего уровня метилирования генома и к летальному исходу развивающихся эмбрионов. Данные о сохранении 30%-ного уровня метилирования ДНК и способности эмбриональных стволовых клеток, лишенных метилазы Dnmt1, метилировать ретровирусную ДНК de novo указывали на выполнение этих функций другими ДНК-метилазами. Поиск таких ДНК-метилаз у животных выявил новые ферменты семейств Dnmt2 и DnmtЗ.

Семейство Dnmt2. ДНК-метилаза Dnmt2 состоит из 415 аминокислотных остатков, лишена N-концевого домена и предположительно не обладает метилтрансферазной активностью. Однако в дальнейшем было установлено проявление этим ферментом активности в клетках человека и дрозофилы. В эмбриональных стволовых клетках мыши инактивация гена Dnmt2 путем гомологичного нокаута не выявила заметного изменения в поддерживающем метилировании и метилировании ДНК de novo, что оставляет невыясненной функцию этого фермента. У растенийи грибов выявлены также гены «коротких» ДНК-метилаз.

Семейство DnmtЗ. Функцию метилирования ДНК de novo выполняют ДНК-метилазы DnmtЗа и DnmtЗb. Dnmt3а и DnmtЗb человека состоят из 908 и 859 аминокислотных остатков, причем ген Dnmt ЗВ путем альтернативного сплайсинга может кодировать ряд более коротких полипептидов. кДНК генов Dnmt ЗА и Dnmt ЗВ мыши проявляет высокую гомологию с соответствующими кДНК человека. На функцию метилирования ДНК de novo указывает равная эффективность модификации этими ферментами последовательностей СрG в полуметилированных и неметилированных нативных и синтетических субстратах, а также значительное уменьшение их активности в зрелых соматических тканях. Высокая экспрессия генов Dnmt ЗА и Dnmt ЗВ отмечена в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, где кодируемые ими метилазы играют важную роль не только в установлении, но и в поддержании обшей картины метилирования ДНК В то же время в этих дифференцирующихся клетках и в соматических тканях взрослого организма экспрессия этих генов крайне мала. Инактивация генов Dnmt ЗА и Dnmt ЗВ путем гомологичного нокаута в эмбриональных стволовых клетках приводила к потере способности этих клеток метилировать ретровирусную ДНК de novo. Эти гены существенны также для нормального постэмбрионального развития мышей: дефектные по этим генам животные погибали спустя четыре недели после рождения.

Хотя ферменты DnmtЗа и DnmtЗb выполняют сходные или перекрывающиеся функции, они проявляют и специфические различия. Так, метилаза DnmtЗb ответственна за метилирование центромерных линкерных сателлитных повторов, а мутации гена Dnmt ЗВ у человека приводят к ICF-синдрому (immunodeficiency, centromeric instability, facial anomalies). 1СF-Синдром — редкое аугосомное рецессивное заболевание, характеризующееся различными иммунологическими дефектами и аномальным строением лица. Он связан с нестабильностью центромерного гетерохроматина. При IСF-синдроме отмечается гипометилирование сателлитных ДНК II и III - главных компонентов конститутивного гетерохроматина.

Важно отметить присутствие в клетках млекопитающих особого белка семейства DnmtЗ, обозначенного как Dnmt3L Этот белок не проявляет метилтрансферазной активности, так как у него отсутствуют или укорочены несколько ключевых аминокислотных мотивов. В то же время в клетке Dnmt3L стимулирует активность ДНК-метилаз DnmtЗа и DnmtЗb и прямо с ними взаимодействует. Устаноатена совместная локализация всех белков семейства DnmtЗ в ядре и необходимость наличия DnmtЗb для регуляции метилирования ДНК de novo и установления геномного импринтинга. Следует отметить, что в ассоциации с гистоновой деаиетилазой DnmtЗb выполняет также функцию транскрипционного репрессора.

Проведенный анализ ДНК эмбриональных стволовых клеток мыши выявил значительное метилирование в ней последовательностей СрА и в меньшей степени СрТ (15—20% общего метилирования цитозина). Это «не-СрG»-метилирование отмечено как в симметричных Ср(N)_nрG-последовательностях, так и в несимметричных сайтах. В эмбриональных стволовых клетках с инактивированиым геном ДНК-метилазы Dnmt1 доля «не-СрG»-метилирования увеличивалась до 45% общего метилирования ДНК, что указывало на связь этой ДНК-метилазной активности с генами Dnmt ЗА и Dnmt ЗВ. Действительно, ДНК трансгенных клеток дрозофилы с экспрессируемым геном Dnmt ЗА наряду с последовательностью СрG содержал метилированный цитозин также в последовательности СрА. Метилазы DnmtЗ имеют значительно укороченный N-концевой домен по сравнению с метилазой Dnmt1, но в этом домене имеются области связывания с различными репрессорами (таблица). Благодаря этому свойству все метилазы семейства DnmtЗ способны выполнять функцию транскрипционных репрессоров, независимую от своей каталитической

ДНК-метилтрансферазной функции.