Опыт 3. Количественное определение активности дегидрогеназ

Окраска тканей разных растений тетразолием позволяет количественно оценить их дегидрогеназную активность.

Цель работы: сравнить активность дегидрогеназ в разных растениях.

Материалы и оборудование: ФЭК, стеклянные бюксы, весы торсионные, лезвия безопасной бритвы, 0,1% раствор ТТХ (трифенилтетразолий хлористый) в 0,87% растворе K₂HPO₄, 0,87% раствор K₂HPO₄, этанол, медицинский шприц, мерные цилиндры на 10 мл.

Растения: набухшие, но не проросшие семена и проростки бобов, фасоли, тыквы, спящие и прорастающие почки деревьев.

Ход работы: зародыши освобождают от семенной кожуры, с почек снимают чешуи. Берут по две навески (200-300 мг) исследуемых объектов – семядолей или почек без чешуй. Разрезают лезвием безопасной бритвы на тонкие пластинки толщиной 1-2 мм. Срезу разных объектов помещают в отдельные стеклянные бюксы. В один бюкс наливают 10 мл раствора ТТХ, в другой – 10 мл 0,87% раствора K₂HPO₄. Затем все срезы в вариантах инфильтруют этими же растворами с помощью медицинского шприца. После инфильтрации срезы переносят вновь в бюксы, закрывают крышками и помещают на 30 мин в термостат с температурой 37ºС. Срезы в бюксах с раствором ТТХ приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.

Затем срезы каждой пробы вынимают из бюкса и растирают в ступке с небольшим количеством этанола. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят этанолом до определенного объема (5-10 мл), выбранного по интенсивности окраски раствора, - чем интенсивнее окраска, тем больший можно выбрать объем. Остатки измельченных образцов должны полностью обесцветиться. После растирания пробы центрифугируют, и полученный экстракт, окрашенный формазаном, сразу колориметрируют на ФЭКе при синем светофильтре. Если в исследуемых тканях имеется хлорофилл и контрольная вытяжка окрашивается в зеленый цвет, а опытная – вместо красного в бурый, то колориметрирование проводят при зеленом светофильтре, что значительно снижает помехи, обусловленные дополнительным зеленым окрашиванием. Об активности дегидрогеназ судят по разнице в оптической плотности между величиной показаний ФЭКа в опытной и контрольной пробах. Для получения достоверных данных по активности дегидрогеназ в данном объекте исследование необходимо повторить не менее 3 раз. Величину дегидрогеназной активности в данных объектах выражают относительных единицах, исходя их разницы в величинах оптической плотности опытной (с ТТХ) и контрольной (без ТТХ) проб.

Задание: сделайте вывод об активности дегидрогеназ в разных растениях.