Этапы получения моноклональных антител

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:

ﭼ иммунизация животных;

ﭼ подготовка клеток к слиянию;

ﭼ слияние;

ﭼ отбор индуцирующих специфических антитела клонов;

ﭼ клонирование и реклонирование;

ﭼ массовая наработка гибридомных клеток;

ﭼ получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

ﭼ выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 месяца.

Организация работы и оборудование.

Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:

1. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0,3 мкм.

2. Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и концентрация СО2.

3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с охлаждением.

4. Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.

5. Холодильник на +4 и на –200 С.

6. Водяная баня на +37 и +560 С.

Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования.

Основными средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Выбор экспериментального животного.

Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных.

Другие животных практически не используются.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки антигена.

Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы выделять селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введения антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого, используют введение антигена, преципитированного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект – отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт набирают животных с высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов гибридизации, если при иммунизации животных нет образования антител или они образуются в низком титре.

В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд существенных преимуществ:

a) укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;

b) требуется существенно меньшее количество антигена;

c) ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);

d) повышается процент отвечающих клеток;

e) легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.

Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системах культивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Метод суспензионного культивирования был первым методом, в котором иммунизация полностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе были низкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность клеток, легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана).

Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д. Марбрука. Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, через которую идет обмен средой из большого резервуара.

Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является доля IgM-образующих клонов. Это связано с тем, что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторичного иммунного ответа, при котором образуются в основном антитела IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному типу, для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема может быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro.