Витамины В2, В3, В5, В12. Технология получения

Биологическая роль витаминов определяется их каталитическим, некоферментным и антимутагенным действием. Многие витамины (практически все витамины группы В) входят в состав коферментов различных ферментов, например, витамин В₂ – в состав коферментов ФАД, ФМН, витамин В₅ – в состав НАД и НАДФ, витамин В₃ – в состав КоА и т. д.

Некоферментные функции витаминов заключаются в участии их в регуляции синтеза нуклеиновых кислот, белков, в формировании структуры клеточных мембран. Важное значение имеет антимутагенное действие витаминов С, Е (α-токоферола) и β-каротина (провитамина А). Эти витамины могут нивелировать как спонтанные мутации, так и мутации, индуцированные ионизирующими излучениями и канцерогенами.

В природе источником витаминов являются главным образом растения и микроорганизмы. Животные получают витамины с пищей, а также в результате жизнедеятельности микроорганизмов кишечника. Организм человека многих витаминов не синтезирует.

Мировой рынок витаминов составляет более 70 тыс. т в год. Около 50% от общего объема производства составляет витамин С. Ведущее место в производстве витаминов занимает швейцарский концерн «Hoffman La Roche», на долю которого приходится 50–70% от общего объема производства витаминов.

Большая часть витаминов производится химическим синтезом. Микробиологическим путем получают витамины В₂, В₁₂, D₂, С (стадия биотрансформации D-сорбита в L-сорбозу), β-каротин.

12.1. Технология кормового препарата витамина В₁₂

Витамин В₁₂ имеет самое сложное строение среди неполимерных соединений. Молекула витамина включает корриновое кольцо из четырех пятичленных азотсодержащих гетероциклов, связанных с атомом кобальта четырьмя координационными связями. Все разнообразие аналогов витамина В₁₂ обусловлено природой верхнего и нижнего лигандов атома кобальта. В истинном витамине В₁₂ (цианкобаламине) верхним лигандом является цианогруппа. Ее место могут занимать другие заместители: группа -ОН – оксикобаламин, -СН₃ – метилкобаламин, 5-дезоксиаденозил – аденозилкобаламин и др. При этом образуются производные витамина, обладающие биологической активностью для животных и человека.

Нижним лигандом атома кобальта в молекуле витамина В₁₂ является специфическое азотистое основание – 5,6-диметилбензимидазол (5,6-ДМБ), которое в природе встречается только в этом соединении. Непосредственным предшественником 5,6-ДМБ является рибофлавин. Наличие 5,6-ДМБ определяет биологическую активность корриноидов. Микроорганизмы могут синтезировать производные витамина, содержащие в качестве нижнего лиганда другие заместители: 5-оксибензимидазол (производное имеет название фактор III), 5-метоксибензимидазол (фактор IIIm), метиладенин (фактор А), аденин (псевдовитамин В₁₂). Нижний лиганд может отсутствовать (фактор В). Биологической активностью обладают лишь формы, содержащие в качестве нижнего лиганда 5,6-ДМБ. В меньшей степени биологически активны фактор III и фактор IIIm. Псевдовитамин В₁₂ и фактор А активностью не обладают.

Промышленным способом получения витамина В₁₂ является микробиологический синтез (химический синтез осуществлен, но отличается большой сложностью). В природе корриноиды обнаруживают в растениях, развивающихся в симбиозе с азотфиксирующими бактериями. Происхождение этих корриноидов окончательно не установлено. Организм животных и человека не способен к самостоятельному синтезу витамина В₁₂. Не образуют корриноиды дрожжи и мицелиальные грибы. Способность к биосинтезу корриноидов широко распространена среди прокариот.

Путь биосинтеза витамина В₁₂ известен. Общим интермедиатом на начальном этапе биосинтеза корриноидов является аминолевулиновая кислота, которая образуется у большинства микроорганизмов в результате конденсации глицина и янтарной кислоты в виде сукцинил-КоА.

Препараты витамина В₁₂ широко применяются в медицине (лечение лучевой болезни, злокачественного малокровия, болезни Боткина, дистрофии, язвы желудка и т. д.), а также для обогащения кормов (улучшают усвоение белка и повышают прирост массы животных на 10–15%).

Мировое производство витамина В₁₂ составляет около 10 т в год, из которых 6,5 т – на медицинские цели. В промышленном производстве в качестве продуцентов витамина В₁₂ используют пропионовокислые бактерии (Propionibacterium shermanii), актиномицеты (Nocardia rugosa), термофильные (реже мезофильные) метаногенные бактерии.

Кормовой препарат витамина В₁₂ для нужд животноводства получают термофильным метановым сбраживанием жидких отходов микробиологического производства органических растворителей – ацетоно-бутиловой и спиртовой барды, содержащей сухих веществ 2,2–2,6% и 6,0–8,0% соответственно. В состав сухих веществ барды входят белки, аминокислоты, углеводы, летучие жирные кислоты, витамины, неорганические соединения.

Для метанового брожения применяют декантат ацетоно-бутиловой барды (рис. 12.1). Осадок взвешенных веществ, содержащий мертвые клетки продуцентов ацетона и бутанола, используют в качестве кормовой добавки. Декантированную барду охлаждают со снижением температуры от 100 до 55–57°С (температура метанового сбраживания). Выход корриноидов значительно увеличивается при добавлении к барде метанола (5 кг/м³) и хлорида кобальта (5 г/м³). Непрерывное сбраживание барды осуществляют в железобетонных метантенках объемом 2000–4000 м³ по одно- или двухступенчатому режиму. При термофильном метановом брожении в анаэробных условиях развивается биоценоз бактерий, осуществляющих сложный взаимосвязанный процесс расщепления органических веществ до СО₂ и СН₄. Можно выделить четыре основные группы бактерий: гидролизующие (расщепляют биополимеры), углеводсбраживающие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие.

В первой фазе процесса развиваются бактерии-аммонификаторы (разлагают белки, пептиды, аминокислоты до жирных кислот и аммиака) и бродильщики. В результате образования аммиака и нейтрализации жирных кислот рН ферментационной среды повышается до 7,0–7,5. Наступает вторая фаза брожения, в которой интенсивно развиваются сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии.

В производственных условиях метановое брожение целесообразно осуществлять в двух последовательно соединенных метантенках (по двухступенчатому режиму), что приводит к специализации бактерий, развивающихся в аппаратах первой и второй ступеней, в соответствии с фазами брожения и сокращению продолжительности процесса с 3,0–3,5 сут (сбраживание в одну ступень) до 2,5–3,0 сут (две ступени сбраживания). Процесс метанового брожения протекает устойчиво и не нуждается в условиях асептики.

В сброженном растворе накапливается 4–5 г/м³ корриноидов, из которых в среднем 50% приходится на истинный витамин В₁₂, 30% – на фактор III. Установлено, что группа метанобразующих бактерий синтезирует около 75% витамина В₁₂ от общего количества.

Рис. 12.1. Технологическая схема получения кормового концентрата витамина В₁₂ из послеспиртовой барды:

1 – сборник барды; 2 – поверхностный конденсатор; 3 – декантатор; 4 – сборник декантата; 5 – теплообменник;

6 – анаэробный реактор; 7 – стабилизатор бражки; 8 – теплообменник; 9 – газоотделитель; 10 – газгольдер

Видовая принадлежность анаэробных бактерий, продуцирующих витамин В₁₂, окончательно не установлена. Подтверждена продукция корриноидов метанобразующими бактериями Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum.

Установлено, что кокковые формы, составляющие 8–10% от всех бактерий, синтезируют примерно 65% корриноидов, а палочки (90–92%) продуцируют остальные 35% корриноидов.

В процессе брожения образуется биогаз (в среднем 20 м³ на 1 м³ жидкой среды), имеющий следующий усредненный состав (%): СН₄ – 65, СО₂ – 30, Н₂ и Н₂S – 5.

Сброженная барда имеет величину рН 7,5–8,0. В щелочной среде витамин В₁₂ неустойчив, поэтому для стабилизации витамина метановую бражку подкисляют до рН 5,5–6,0 и вводят 0,2–0,3% сульфита натрия. Перед подачей на упаривание для обеспечения безопасности процесса бражку подвергают дегазации нагреванием в теплообменнике до 90–95°С с последующим отделением газов в объемном сепараторе. Дегазированную бражку сгущают до 20% сухих веществ упариванием в трех- или четырехкорпусных вакуум-выпарных установках. Концентрат высушивают в распылительной сушилке при температуре теплоносителя на входе в сушилку 280°С. Продукт – кормовой препарат витамина – представляет собой порошок коричневого цвета и содержит витамин В₁₂ в количестве не менее 100 мг/кг, а также сырой протеин – не менее 25%.

Витамин В₁₂ для медицинских целей получают культивированием бактерий Propionibacterium shermanii периодическим методом при температуре 28–30°С в анаэробных условиях с соблюдением правил асептики на питательной среде, содержащей глюкозу (40 г/л), кукурузный экстракт (40 г/л), сульфат аммония (2 г/л) и хлорид кобальта (0,005 г/л); рН среды 6,8–7,0. Ферментация протекает в две фазы. В первой фазе продолжительностью 65–70 ч бактерии интенсивно размножаются с накоплением пропионовой и уксусной кислот, подлежащих нейтрализации, и предшественника витамина В₁₂ – фактора В (без нижнего лиганда). На долю фактора В приходится более 80% от всех синтезированных корриноидов (остальное – цианкобаламин (8–10%), псевдовитамин В₁₂ и фактор А).

Вторая фаза ферментации начитается с момента внесения в среду 5,6-ДМБ в количестве 10–20 г/м³, в результате чего происходит трансформация неактивных аналогов в истинный витамин В₁₂. Продолжительность второй фазы 24 ч. К концу процесса культуральная жидкость содержит около 30 мг/л витамина В₁₂, накопленного в клетках бактерий.

Биомассу отделяют сепарацией и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5–5,0, при температуре 85–90°С в течение часа. После отделения остатка биомассы раствор охлаждают, доводят рН до 6,8–7,0 и осаждают белки коагуляцией в присутствии Al₂(SO₄)₃ или FeCl₃. Осадок отделяют фильтрованием, а раствор витамина очищают на ионообменной смоле СГ-1, с которой витамин В₁₂ элюируют водным раствором аммиака. Элюат упаривают и дополнительно очищают на колонке с окисью алюминия (очистка кобаламинов от аналогов). Элюируют витамин В₁₂ водным ацетоном и кристаллизуют из раствора при температуре 3–4°С в течение 24–48 ч. Кристаллы промывают ацетоном, затем диэтиловым эфиром и сушат под вакуумом.

12.2. Технология кормового препарата витамина В₂

Витамин В₂ (рибофлавин) в промышленных условиях производят для кормовых целей. Продуцентами рибофлавина в природе являются высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Большинство микроорганизмов образуют свободный рибофлавин и две его коферментные формы – ФМН и ФАД. Основной формой флавинов, синтезируемых микроорганизмами, является рибофлавин. Гетероциклическая система рибофлавина представлена тремя конденсированными циклами: ароматическим (А), пиразиновым (В) и пиримидиновым (С). К пиразиновому кольцу присоединен спирт рибит:

Рибофлавин – светочувствительное оранжево-желтое красящее вещество. Водные растворы рибофлавина флуоресцируют на свету, давая желто-зеленое окрашивание. Флуоресцирующая способность витамина используется при его количественном определении. Окислительно-восстановительные свойства флавинов обусловлены наличием в составе молекулы системы, способной к обратимому окислению и восстановлению:

С этим связана биологическая роль витамина В₂, которую в клетках выполняют моно- и динуклеотидные формы рибофлавина.

Путь синтеза рибофлавина в микробных клетках установлен. Предшественником рибофлавина является гуанозинтрифосфат.

Микроорганизмы, как правило, синтезируют рибофлавин в больших количествах, чем необходимо для удовлетворения потребности клетки. Например, дрожжеподобные грибы синтезируют до 6 г/дм³ рибофлавина, в то время как потребность в нем не превышает 0,1 мг/дм³. Высокой рибофлавинпродуцирующей способностью отличаются дрожжеподобные грибы Eremothecium ashbyii (до 2,5 г/дм³ витамина В₂) и Ashbya gossypii (до 6 г/дм³), применяемые в промышленном производстве витамина В₂.

Для большинства микроорганизмов выход рибофлавина увеличивается при дефиците железа в среде. Предполагают, что ионы железа участвуют в регуляции синтеза рибофлавина. Однако для штаммов-сверхсинтетиков E. ashbyii и A. gossypii дефицит железа не влияет на рибофлавинсинтетическую активность. Считают, что указанные продуценты рибофлавина являются природными мутантами с нарушенной регуляцией синтеза витамина.

Получены мутантные штаммы бактерий Bacillus subtilis, способные синтезировать витамин В₂ в количестве до 6 г/дм³. В отечественной практике используют гриб Eremothecium ashbyii. Колонии гриба имеют оранжевый цвет. Интенсивность окраски колоний коррелирует с рибофлавинсинтетической способностью. Недостаток культуры – нестабильность при хранении. Гриб легко теряет способность к сверхсинтезу витамина, поэтому осуществляют систематический отбор наиболее интенсивно окрашенных колоний. Культура A. gossypii (применяется за рубежом) более стабильна, хорошо развивается, используя в качестве источника углерода углеводы (глюкозу, сахарозу), но лучше всего – соевое и кукурузное масло.

Рибофлавин накапливается в мицелии в виде желтых кристаллов, к концу ферментации около 80% рибофлавина выходит из клеток в результате автолиза.

Гриб E. ashbyii образует на дрожжевой агаризованной среде (дрожжевой экстракт 0,2–0,4%, пептон 0,3%, глюкоза 1%) после шести дней роста ярко-оранжевые колонии диаметром 5–8 мм. На соевой агаризованной среде (мука соевая 4,0%, сахароза 2,0%) колонии гриба имеют диаметр 17–25 мм. Для получения посевного материала отбирают типичные колонии с интенсивной окраской. В качестве субстрата для получения спорового материала используют подготовленное пшено высшего качества. Флаконы со стерильным пшеном засевают суспензией (смыв культуры с агаризованной среды) и инкубируют при температуре 30°С в течение 8–9 сут. Пшено после прорастания гриба приобретает ярко-желтый цвет. Полученный посевной материал хранят в темноте при комнатной температуре.

Материалом из флакона засевают качалочные колбы и выращивают культуру 10–14 ч. В качалочных колбах и посевных аппаратах используется среда, содержащая кукурузный экстракт 2%, сахарозу 1%, фосфат калия 0,1% и технический жир 0,5%. Величина рН среды 6,8–7,2. Продолжительность ферментации в посевных аппаратах 24–27 ч при температуре 28–32°С и уровне аэрации 50–60 м³/(м³·ч).

Среда для производственной ферментации содержит соевую муку, кукурузный экстракт, мел, технический жир. В первые сутки культивирования гриб накапливает биомассу, а затем переходит к спорообразованию. В этот период интенсивно синтезируется рибофлавин. Примерно с 60-го часа ферментации начинается автолиз культуры и переход рибофлавина в среду. Продолжительность ферментации 65–68 ч, процесс проводят в условиях асептики.

Культуральную жидкость стабилизируют подкислением до значения рН 4,5–5,0, упаривают под вакуумом до содержания сухого вещества 18–20%, концентрат высушивают распылением в мягких условиях (температура сушильного агента на входе в сушилку 150–160°С). Продукт содержит 20–40 г витамина на 1 кг препарата.

Примерно 70% рибофлавина, произведенного в мире, получают путем химического синтеза из рибозы.