Фізико-хімічні та каталітичні властивості амілаз

Відомо, що продуцентами амілаз є мік-роміцети (Aspergillus, Penicillium, Mucor) І бактерії (Bacillus). Дані щодо деяких їхніх фізико-хімічних властивостей наведено в табл. 2.

Дослідження α-амілаз А. Flavus, A. Awa-Mori Та A. Oryzae [17] показало, що вони ха­рактеризувались однаковими значеннями рН-оптимумів активності 5,0–5,25; зона їхньої рН-стабільності — 6,0–8,0; точка най­більшої стійкості — 7,0. Усі три α-амілази стабільні при кімнатній температурі, утім фермент А. Flavus Був стійкішим до нагріван­ня, ніж A. Awamori Та A. Oryzae, і при 55 0С протягом 1 год зберігав 70% вихідної актив­ності. Температурний оптимум α-амілази А. Flavus — 50 0С, а α-амілаз A. Awamori Та A. Oryzae — 40 0С. Стабільність досліджува­них ферментів до теплової денатурації під­вищувалась у присутності субстрату (крох­малю). Галогеніди у концентрації 0,25 М не стабілізували α-амілази, а навпаки, приско­рювали їх інактивацію. Цей вплив зростав у послідовності Cl– < Br– < F– < I– і притаман­ний усім трьом ферментам. Сечовина конце­нтрацією від 1,0 до 6,0 М денатурувала білки. Інактивуюча дія була більш вираже­ною для α-амілаз A. аWamori Та A. Oryzae, стійкішим був фермент із А. Flavus. ЕДТА — сильний інгібітор усіх трьох α-амілаз, а ато­ми кальцію — важливі для їхньої актив­ності й стабільності.

Оскільки мікробна конверсія крохмалю і дотепер залишається одним із важливих напрямів досліджень у біотехнології, для удосконалення біотехнологічних процесів необхідним є пошук високоефективних амі-лолітичних ферментів з новими властивос­тями. Так, автори [18] із 245 штамів морських грибів відібрали перспективний продуцент позаклітинних амілаз — Aspergillus Flavipes І показали, що залежно від умов культиву­вання він здатен продукувати різні амілолі-тичні комплекси. На живильному середо­вищі, яке містить пептон і дріжджовий екстракт (рН 7,0), A. Flavipes Синтезував три форми амілази, які відрізнялись оптимумом рН. Зміна початкового значення рН середо­вища (8,6) або видалення з живильного сере­довища пептона супроводжувалось утворен­ням однієї з форм ферменту. Присутність протеолітичних ферментів знижувала актив­ність ізольованих форм амілаз. У разі вне­сення в живильне середовище інгібітору протеаз діізопропілфторфосфату синтезува­лась нова форма амілази з оптимумом рН 5,5 та 7,5, максимальною активністю при 60–80 0С і високою стабільністю. Амілаза 1 виявляла активність у широкому діапазоні значень рН (5,5–8,0), оскільки становила суміш двох молекулярних форм: кислої (м. м. 50 кДа, оптимальне значення рН 6,0, термооптимум 30–50 0С) і лужної (м. м. 14,5 кДа, оптимум рН 7,5, термооптимум 30–50 0С) амілаз. Амілаза 2 мала характерні для більшості грибних амілаз властивості: м. м. 63 кДа, оптимум рН 5,5, максимальна активність у діапазоні температур 30–50 0С і темпера­турна стабільність до 50 0С. Однак досліджу­вані форми амілаз були нестабільними у процесі виділення внаслідок присутності протеолітичних ферментів. Амілаза 3 (м. м. 50 кДа) помітно відрізнялась від вищезазна­чених форм ферменту. Вона виявляла ак­тивність у широкому діапазоні рН (5,5–8,5), два максимуми активності при 5,5 і 7,5 і температурі 60–80 0С, мала високу термо­стабільність (70 0С) і зберігала початкову ак­тивність упродовж 20 днів при температурі 22 0С за обох значень рН. Амілаза 3 була ме-талозалежним ферментом, її активність під­вищували іони Ca2+ і Mg2+, інгібували — ЕДТА й деякі метали — Cu2+, Zn2+, Co2+. На відміну від амілаз морських бактерій, амілаза морського гриба A. Flavipes Виявляла стій­кість до екстремально високих концентра­цій солі (15% NaCl).

A. Niger 1119 під час глибинного вирощу­вання продукував амілази з високою актив­ністю (3,9 Од ·мл–1) при 50–55 0С і рН 4,0 і зберігав стабільність при 53 0С протягом 200 год. Для того щоб встановити, чи можна використовувати цей фермент у процесі очищення, різні детергенти досліджували

З використанням екстракту амілази A. Niger І встановили можливість їх застосування для очищення хірургічних і ендоскопічних інструментів [19].

Деякі дослідники [20] показали здат­ність Твін-80 і рамноліпіду стимулювати ак­тивність позаклітинної амілази PenicilliumSimplicissium.

Амілазу виявили також у різних пред­ставників бактерій, як патогенних (Vibrio Cholerae, B. Anthracis, Streptococcus, Staphy-Lococcus, Pneumococcus), так і непатогенних (B. Mesentericus, B. Subtilis, B. Macerans) видів. Промислове значення, безумовно, мо­жуть мати і фактично мають лише непато-генні бактерії. На особливу увагу заслугову­ють термостабільні амілази, які здатні гідролізувати нативний крохмаль і витри­мувати високі концентрації солей, а також лужні амілази, оскільки більшість відомих грибних амілаз, що їх широко застосовують у промисловості, виявляють активність у кислому середовищі.

Амілолітичні ферменти термофільного штаму Bacillus Sp. 86 виявляли активність при температурі 30–95 0С (термооптимум 85–90 0С) і в інтервалі значень рН 5,0–10,5 з двома рН-оптимумами (6,0 і 8,5). Ак­тивність препарату при 60 0С залишалася без змін протягом 4 год, а час його напівак-тивації при цій температурі — 9 год, при 90 0С активність препарату не змінювалась упродовж 50 хв, а час напівактивації стано­вив 2 год [21]. Здатність досліджуваного ферменту здійснювати гідроліз крохмалю в умовах слабокислого, нейтрального і луж­ного середовищ є істотною перевагою перед іншими α-амілазами і зумовлює можливість використання його як каталізатора різних промислових реакцій розрідження крохма-левмісної сировини. Іони кальцію, які не впливають на активність α-амілази, значно підвищують стабільність ферменту, до того ж потреба в іонах цього металу зростає з під­вищенням температури інкубації. Крохма­лю, як специфічному субстрату α-амілази, також притаманний високий стабілізуваль-ний ефект. У 22,5%-му розчині крохмалю α-амілаза Bacillus Sp. 86 За відсутності іонів кальцію цілком стабільна протягом 100 хв при 90 0С і 80 хв при 100 0С. Встановлено, що даний фермент є глікопротеїном. Білко­ва глобула ферменту тісно зв’язана з вугле­водним компонентом, який становить до 16% сухої маси. Молекулярна маса α-аміла­зи дорівнює 83–90 кДa. Молекула α-амілази Bacillus SР. 86, що містить 16 амінокислот і налічує в середньому 254 амінокислотних залишки, відзначається високим вмістом аспарагінової і глутамінової кислот, алані­ну, валіну і триптофану. У молекулі фермен­ту не виявлено цистеїну. Припускають, що роль дисульфідних зв’язків у створенні структури термостабільної α-амілази віді­грають іони кальцію [15].

Високотермостабільну амілазу, яка про­дукується Bacillus Sp. PN5, було ізольовано з ґрунту [22]. У разі вирощування на середо­вищі, яке містить (%) крохмаль (0,6), пептон (0,5) і дріжджовий екстракт (0,3), при 60 0С, рН 7,0, упродовж 60 год активність амілази, яка продукувалась, становила 65,23 Од/мл. Максимуму активності було досягнено при рН 10,0 і температурі 90 0С. Активність фер­менту пригнічувалась при 105 0С на 65%, а при температурі від 80 до 100 0С була ста­більною протягом 1 год. Фермент зберігав 83% активності після 1 год інкубації з доде-цилсульфатом натрію. Ці властивості вказу­ють на можливість використання даної амілази при цукрофікації крохмалю і утво­ренні детергенту.

У Росії на цей час у промисловому масш­табі виробляють препарати α-амілази на ос­нові двох продуцентів — B. Subtilis (аміло-субтилін) і A. Oryzae (амілоризин) [23]. Однак ці амілази не належать до термо­стабільних ферментів, оскільки оптимальна температура їхньої дії 55–65 0С. Автори [23] методами мутагенезу і селекції одержали високопродуктивний штам B. Licheniformis 103, який здатен синтезувати термостабільну α-амілазу (температурний оптимум 90–95 0С, рН-оптимум 6,0–8,5). Оптимізацією складу ферментаційного середовища і умов глибин­ного культивування продуцента їм вдалося майже у 8 разів у порівняно з вихідним шта­мом підвищити активність амілази, яка ста­новила 260 Од ·мл–1.

За допомогою іонообмінної хроматогра­фії і гель-фільтрації очистили позаклітинну α-амілазу B. Subtilis [24]. Молекулярна маса її дорівнювала 48 кДа. Різноманітні іони ме­талів навіть за низьких концентрацій інгібували активність α-амілази. Ca2+, Ba2+, Mn2+ і Ni2+ були слабкими, а Zn2+, Fe2+, Pb2+, Hg2+, Mg2+, Cd2+ і Cu2+ — сильними інгібітора­ми. Високі концентрації Ca2+ сприяли зни­женню ферментативної активності, а за концентрації 2,5 мМ активність підвищува­лась. ЕДТА також впливав на активність, аналогічно до впливу Ca2+ за низьких концент­рацій. Відзначено підвищення активності ферменту в разі використання іонів металів у концентрації 10 мМ. Показники Km і Vmax для α-амілази становили 2,2•10–4 г•мл–1 і 0,020 Од•мл–1, 2,91•10–4 г•мл–1 і 0,016 Од•мл–1; 4,04•10–4 г•мл–1 і 0,021 Од•мл–1 у випадку

Використання як субстратів крохмалю, амілози і глікогену, відповідно.

Автори [25] ізолювали штами B. Subtilis JS-2004 з максимальною активністю 72 Од•мл–1 під час вирощування на рідкому середовищі з картопляним крохмалем упро­довж 48 год при рН 7,0 і 50 0С. Додавання іонів Са2+ і дріжджового екстракту підвищу­вало продукування ферменту, тимчасом як додавання 1% глюкози сприяло значному інгібуванню. Оптимальної активності було досягнено при рН 8,0 і 70 0С. Фермент був стабільним протягом 1 год при 60 і 70 0С, водночас при 80 і 90 0С вихідна активність втрачалась на 12 і 48%, відповідно. Фер­мент активували іони Са2+ (117%), значною мірою інгібували іони Со2+, Сu2+ та Hg2+ і мен­шою мірою Mg2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+ і Mn2+. Штам продукував високі рівні α-амілази, яку можна використовувати в крохмале-пато-ковій та харчовій промисловості.

Зі зразків південноамериканських ґрун­тів виділено штам B. Licheniformis MIR-61, який продукував підвищену кількість кис­лої α-амілази. У періодичних культурах B. Licheniformis MIR-61 У фазі експоненцій-ного росту виявляли позаклітинні α-амілази та глюкозидази. Максимальної активності α-амілази було досягнено при 45 0С і рН 7,0 у пізній експоненційній фазі. Оптимум ак­тивності цього ферменту спостерігався при 50–67 0С і рН від 5,5 до 6,0. α-Амілаза ха­рактеризувалася термостабільністю при 60 0С [26].

α-Амілаза B. Licheniformis Є високостабіль-ним ферментом, який широко використову­ють у біотехнологічних процесах. Незважа­ючи на те, що її продукує не термофільна бактерія, вона зберігає активність протягом декількох годин при температурі, вищій за 90 0С, в умовах промислового гідролізу крохмалю. Вона також більш стабільна, ніж α-амілаза B.Stearothermophilus і B. Amyloliq-Uefaciens, Попри значну подібність послідов­ностей між цими трьома білками. α-Амілаза B.Licheniformis є Цікавою моделлю для білкової інженерії під час дослідження тер­мостабільності й термостабілізації. Автори [27] здійснили мутаційний і структурний аналіз α-амілази B. Licheniformis, Для того щоб з’ясувати походження незвичайних термальних властивостей і, якщо можливо, підвищити термостабільність ферменту. Ще до того як було встановлено тривимірну структуру, дослідники використали мутаге­нез та ідентифікували два критичних положення, в яких заміщення амінокислот може або підвищити, або знизити значною мірою необоротну термоінактивацію. Коли деталь­ну Х-променеву структуру α-амілази B. Li-Cheniformis Було встановлено, заснований на структурі мутагенез застосували для визна­чення ролі залишків, які залучаються до ут­ворення сольових містків, зв’язування з кальцієм або потенціальних процесів де-амідування. Результати дослідників [27] свідчать про ключову роль домена В та його взаємодії з доменом А у термостабільності α-амілази B. Licheniformis. Більшість мута­цій, які автори вводили в цю ділянку, так чи інакше модифікували стабільність завдяки впливу на електростатичну взаємодію тріа­ди металів Ca–Na–Ca у місці контакту до­менів А/В. Мутаційні дослідження показали важливість тріади металів для підтримання правильного вигину домену А, а також роз­щеплення конформації активного центру. Однак подібний тріадний металзв’язуваль-ний центр також присутній у менш термос­табільних бактеріальних гомологів, таких як B. Stearothermophilus І B. Amyloliquefaciens. Тому підвищена термостабільність α-аміла­зи B. Licheniformis Не може бути зумовлена присутністю цієї тріади металів. У процесі мутаційних досліджень автори сконструю­вали понад 500 варіантів амілази, що несли від однієї до численних мутацій, серед яких було багато як високошкідливих, так і пев­ною мірою корисних для стабільності. Ку­мулятивний ефект мутацій дав дослідникам можливість модулювати стабільність фер­менту в діапазоні 50 0С, включаючи значне втручання в амілолітичну функцію. Незва­жаючи на те, що повного розуміння похо­дження природної термостабільності α-амі­лази B.Licheniformis Ще не досягнено, дослідження авторів показали, що вона не є оптимальною і що є можливість підвищу­вати або знижувати її штучно декількома шляхами, використовуючи як випадковий, так і цілеспрямований мутагенез. Цікаво, що інженерно створені гіпертермостабільні варіанти α-амілази B. Licheniformis Є також більш стабільними за низьких значень рН.

Вивчаючи взаємодію α-амілази B. Amy-Loliquefaciens З дивалентними катіонами кальцію і кобальту, дослідники [28], встано­вили 17 сайтів зв’язування кальцію на фер­менті зі слабкою позитивною кооперативніс-тю. Зв’язування як кальцію, так і кобальту є екзотермічним процесом. Кальцій стабілі­зував фермент проти сурфактантів і тер­мальної денатурації. Більш того, зв’язуван­ня з кальцієм запобігало спонтанному

Зменшенню біологічної активності α-аміла­зи. На ферменті існує 25 некооперативних сайтів для зв’язування іонів кобальту. Ак­тивність ферменту значно підвищується зі збільшенням концентрації кобальту, але температура денатурації ферменту зни­жується. Таким чином, дивалентні катіони кальцію і кобальту діють як стабілізатор і активатор, відповідно, для α-амілази B. Amyloliquefaciens.

Дослідники показали [29] здатність про­дукувати високоактивну амілазу для шта­мів Streptomyces Somaliensis GS 1242 і Strep-Tomyces Sampsonii GS 1322.

Зростаючи на середовищі з глюкозою, Clostridium Acetobutyricum Продукує по­заклітинну α-амілазу. Фермент достатньо охарактеризований біохімічно, однак його ген поки що не ідентифіковано. Ген AmyP Кодує 80 013-Дa зрілий білок з N-кінцевим доменом, який є ідентичним такому родини 13 глікозилгідролаз, таких як α-амілаза Bacillus. Транскрипційний аналіз показав, що AmyP Транскрибується в розчині хемо-статної культури. Наведені дані відповіда­ють активності α-амілази, а це свідчить про те, що експресія АmyP Регулюється на тран­скрипційному рівні. AmyР Локалізували на ме-гаплазміді pSOL1, яка несе всі гени, що беруть участь у кінцевій стадії утворення розчину. Дегенерація C. Acetobutyricum Пов’язана зі втратою pSOL1. Показано, що AmyP Можна використати як рецепторну систему для ха­рактеристики цього явища [30].

Новий термофільний спороутворюваль-ний штам MR3Ct, що його ізольовано з гео­термального ґрунту, локалізованого на горі Ріттманн в Антарктиці, був здатен продуку­вати позаклітинну амілазу. На основі 16 S рРНК-послідовності було показано, що штам близький до Anoxybacillus Amylolyticus [31].

З Geobacillus Thermodenitrificans HRO10 [32] виділено й очищено до гомогенного ста­ну (13,6 раза, 11,5% вихід) α-амілазу. Мо­лекулярна маса, визначена за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу, становила 58 кДа. Активність була оптимальною на картопля­ному крохмалі при рН 5,5 і 80 0С. У присут­ності іонів Са2+ залишкова активність дося­гала 92% після 1 год інкубації при 70 0С. α-Амілаза не втрачала активності у присут­ності фітату (селективний інгібітор α-аміла­зи) у концентрації 10 мМ і зберігала 90% максимальної активності після 1 год інку­бації при 70 0С. ЕГТА і ЕДТА були сильними інгібіторами ферменту. α-Амілаза гідролізу-вала розчинний крохмаль при 80 0С з Km 3,05 мг·мл–1 і Vmax 7,35 Од·мл–1. Здатність до продукування позаклітин­ної α-амілази було виявлено і в галофільної бактерії Halomonas Meridiana [33]. Найви­ща продукція α-амілази спостерігалась на­прикінці логарифмічної фази під час зрос­тання культури на середовищі з 5% солей чи крохмалю за відсутності глюкози. Фермент виявляв максимальну активність при рН 7,0, але був відносно стійким і в лужних умовах. Оптимальні значення температури і солоності для активності α-амілази станов­лять відповідно 37 0С і 10% NaCl.

У біотехнологічних процесах, а саме у ферментативному гідролізі крохмалю у про­цесі одержання глюкози, використовують амілолітичні ферменти, які синтезуються термофільними археями [34].

Здатність до синтезу термостабільної α-амі­лази виявлена у Thermomyces Lanuginosus F1. Молекулярна маса й ізоелектрична точ­ка для цього ферменту становили відповідно 55 кДа і 4,0. Максимальну стабільність α-амі­лаза виявляла при рН 4,0 і зберігала > 80% активності за рН 5,0–6,0 протягом 24 год. Після інкубації при 90 0С упродовж 1 год α-амілаза зберігала лише 6% активності. Ак­тивність ферменту зростала у присутності Mn+2, Co+2, Cu+2, Zn+2 і Fe+2, але інгібувалася гуанідин-НСІ, сечовиною і ЕДТА. Цей фер­мент має такі параметри рН і термостабіль­ності, які роблять його перспективним для промислового використання [35].

Таким чином, представники різних так­сономічних груп мікроорганізмів здатні продукувати активні α-амілази, з різнома­нітними фізико-хімічними властивостями, що визначає практичне використання їх у різних сферах життєдіяльності людей.